ХИМИЧЕСКАЯ ФИЗИКА, 2010, том 29, № 8, с. 73-77
ХИМИЧЕСКАЯ ФИЗИКА БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ
УДК 541.127:581.192
СОДЕРЖАНИЕ И АКТИВНОСТЬ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ АНТИОКСИДАНТОВ В ПИЩЕВЫХ И ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЯХ © 2010 г. В. А. Волков1, Н. Н. Сажина2*, П. М. Пахомов1, В. М. Мисин2
1Тверской государственный университет 2Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук, Москва
*Е-таИ: Natnik48s@yandex.ru Поступила в редакцию 26.06.2009
Проведен количественный анализ суммарного содержания низкомолекулярных антиоксидантов в экстрактах пищевых и лекарственных растений с помощью метода, основанного на взаимодействии антиоксидантов со стабильным радикалом 2,2-дифенил-1-пикрилгидразилом, и амперометриче-ского метода. Показана высокая корреляция (г = 0.96) результатов. Проведен сравнительный анализ суммарного содержания антиоксидантов, а также их активности в отношении стабильного радикала ДФПГ в 14 лекарственных и пищевых растениях.
Ключевые слова: растения лекарственные и пищевые, антиоксиданты низкомолекулярные.
ВВЕДЕНИЕ
К настоящему времени разработано множество различных методов определения количества антиоксидантов (АО) в пищевых продуктах, биологически активных добавках, лекарственных препаратах, биологических жидкостях и других системах, их активности в отношении свободных радикалов, а также способности ингибировать реакции окисления, протекающие по цепному перекисно-му механизму [1—4]. Однако вопрос, насколько сопоставимы между собой результаты, получаемые с помощью различных методов, в большинстве случаев остается неясным [5]. Возникают задачи, связанные с проведением широкомасштабных исследований по сравнительному тестированию различных методов определения содержания антиоксидантов, а также антирадикальной и антиоксидантной активности АО и их смесей с целью разработки соответствующих стандартов.
В данной работе проведен сравнительный анализ содержания низкомолекулярных антиокси-дантов в экстрактах 14 пищевых и лекарственных растений с помощью двух методов: амперометри-ческого и метода, основанного на взаимодействии низкомолекулярных АО со стабильным хромоген-радикалом — 2,2-дифенил-1-пикрил-гидразилом (ДФПГ).
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Образцы высушенных лекарственных трав были приобретены в аптеке; фрукты, лук, чеснок и чай "Каркаде" — в продовольственном магазине. Образцы измельчали в мельнице. Экстракцию
этиловым спиртом, водой или их смесью производили с помощью встряхивающего устройства. Из мякоти цитрусовых механически отжимали сок, после чего из оставшейся части дополнительно экстрагировали содержащиеся в ней АО.
Определение активности экстрактов в отношении радикала ДФПГ
Количественное определение содержания в экстрактах веществ, активных в отношении ДФПГ, проводили по общеизвестной методике [6]. Раствор (8.7 • 10-5 М) ДФПГ фирмы "Sigma-Aldrich" (ю = 97%) в этаноле, очищенном перегонкой, готовили непосредственно перед экспериментом. Из исходного экстракта готовили серию последовательных разбавлений; 0.8 мл каждого из полученных растворов серии приливали к 2.4 мл раствора ДФПГ и через 30 мин (T = 293 K) регистрировали значения оптической плотности при X = 517 нм на спектрофотометре "Specord M40" ("Carl Zeiss", Jena, ГДР). В контрольном опыте вместо экстракта в реакционную систему вводили чистый этанол. Из графика зависимости величины падения оптической плотности раствора ДФПГ от коэффициента разбавления исходного экстракта методом линейной интерполяции определяли значение коэффициента разбавления К, необходимое для достижения концентрации экстракта IC50, при которой падение оптической плотности за первые 30 мин реакции составляет 50%. В указанных условиях эксперимента 1 мМ ДФПГ взаимодействует с 0.23 мМ (70 мг) квер-цетина. Поэтому вычисление содержания анти-
оксидантов САО (в мг/г) в пересчете на кверцетин в анализируемом образце проводили по формуле
Сао = 70ДСDPPH VyStКVeXtr/( VaIm),
(1)
где ДСОТРН — падение концентрации ДФПГ за первые 30 мин реакции, моль/л; Vsyst — объем реакционной системы, мл; Vextr — объем полученного экстракта, мл; Val — объем аликвоты разбавленного экстракта, введенной в реакционную систему, мл; m — масса навески анализируемого образца, взятой для приготовления экстракта, г.
Определение антирадикальной активности экстрактивных веществ, содержащихся в анализируемых объектах, проводили с помощью метода, предложенного авторами работы [7]. Смешивание реагентов проводили при тех же их концентрациях и объемах, что и в ходе количественного определения АО (концентрация экстракта бралась равной IC50), но реакционная среда была
подкислена 0.1 мМ HCl1. Запись кинетической кривой падения оптической плотности раствора радикала ДФПГ производили сразу же после смешивания. Начальную скорость реакции w0, являющуюся искомым кинетическим параметром, рассчитывали с помощью программы Microcal Origin 7.0 с учетом интервала времени от момента смешивания реагентов до начала регистрации сигнала данных прибором. Все анализируемые кинетические кривые с высокой точностью (r2 = = 99.9) описываются уравнением
Ddpph = Dx + ^iexp(-i/ai) + A2exp(-t/a2), (2)
где Ddpph — оптическая плотность раствора при X = 517 нм; t — время от начала реакции; Dx, A1, A2, a1, a2 — параметры, подбираемые программой (буквенные обозначения изменены с учетом их физического смысла). Поэтому
w0 = (Aj/a1 + A2/a2) Sdpph ,
(3)
где еОТРН = (1.15 ± 0.02) • 104 моль 1 • см 1 — молярный коэффициент экстинкции ДФПГ в этаноле [8].
Обнаружено, что для кверцетина в указанных выше условиях количественного эксперимента величина 1С50 = 7.515 • 10-6 М. Поэтому можно вычислить эффективную (кажущуюся) константу скорости взаимодействия АО исследуемого объекта с ДФПГ в начальный момент времени в пересчете на стехиометрию кверцетина:
kef = V>/(7.515 • 10-6[DPPH]0).
(4)
1 При исследовании экстрактов цитрусовых и луковых эта
концентрация составляла 3.3 мМ, поскольку для их АО ми-
нимальное значение скорости процесса наблюдалось при
этой концентрации.
Введение соляной кислоты в реакционную систему позволяет достичь двух положительных эффектов:
1) резко замедлить реакцию за счет подавления ионизации фенольных АО, что позволяет обойтись без применения специального оборудования для исследования кинетики быстрых процессов и повысить точность расчетов;
2) нивелировать непредсказуемое влияние на скорость реакции слабых органических кислот, которые всегда содержатся в спиртовых извлечениях из растений.
При этом с помощью соляной кислоты происходит подавление протекания реакции по механизму SPLET [9], который не реализуется при ин-гибировании антиоксидантами процессов цепного перекисного окисления в липофильной среде.
Определение суммарного содержания АО в экстрактах амперометрическим методом
Амперометрическая установка ЦветЯуза-01-АА (НПО "Химавтоматика") представляет собой электрохимическую ячейку со стеклоуглеродным анодом и катодом из нержавеющей стали, к которым приложена разность потенциалов в 1.3 В [10]. Анализируемая проба с помощью шестиходового крана-дозатора вводится в элюент (слабый раствор ортофосфорной кислоты), прокачиваемый насосом через электрохимическую ячейку. При прохождении пробы через ячейку регистрируется ток электрохимического окисления АО, развертка которого во времени выводится на монитор компьютера. Предварительно строили градуиро-вочную зависимость сигнала (площади под ампе-рометрической кривой) образца сравнения, в качестве которого был использован кверцетин, от его концентрации.
Зная площадь под кривой, получаемой от исследуемого экстракта в пределах диапазона градуировки, можно определить в нем содержание АО в пересчете на кверцетин и, соответственно, содержание АО в тканях исследуемого растения (в мг/г):
Сао = (S/S,)C,KVeJm,
(5)
где S — площадь под амперометрической кривой исследуемого образца, нА • с; S0 — площадь под амперометрической кривой кверцетина, нА • с; С0— концентрация раствора кверцетина, мг/мл; К — коэффициент разбавления анализируемого экстракта перед введением в прибор, Vextr — объем полученного экстракта, мл; m — масса навески анализируемого образца в граммах, взятой для приготовления экстракта в объеме Vextr Метод не требует использования модельной реакции, а время измерения одного образца составляет 10— 15 мин при наличии градуировочной прямой.
Результаты количественного определения и кинетического анализа низкомолекулярных АО в некоторых пищевых и лекарственных растениях
Анализируемый объект Экстрагент Соотношение навеска/экс-трагент, г/л САО (в пересчете на кверцетин)*, мг/г ^о ■ 108, моль/л ■ с** кер л/моль■С
ДФПГ амперо-метрия
Мята перечная этанол : вода (70 : 30) 10 32 17 2.0 41
Зверобой продырявляенный » 10 41 32 2.1 43
Мелисса лекарственная » 10 12 12 2.4 49
Тысячелистник обыкновенный » 10 11 13 2.3 48
Ромашка аптечная » 10 8.1 9.3 2.6 53
Пижма обыкновенная » 8.3 16 13 2.0 41
Чай "Каркаде" вода (70 : 30) 10 11.5 8.2 24 500
Яблоко (сорт "Гольден") этанол : вода (70 : 30) 10 0.51 0.65 5.0 100
Виноград красный » 10 2.0 1.6 4.3 87
Лимон этанол (96%) 100 0.53 1.1 13 260
Апельсин » 100 0.51 1.2 11 220
Грейпфрут » 100 0.55 1.0 9.1 190
Лук (луковицы) » 50 0.065 0.46 11 210
Чеснок (луковицы) » 50 0.24 2.8 6.6 140
* Относительная погрешность составляет около 5%. ** Погрешность определения составляет <20%.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты количественного определения низкомолекулярных АО в исследуемых экстрактах пищевых и лекарственных растений, представлен-
ные в таблице, демонстрируют высокую корреляцию (г = 0.96) между результатами, получаемыми с помощью сопоставляемых методов (рис. 1). Линия регрессии на корреляционной диаграмме имеет тангенс угла наклона, равный 0.72 ± 0.06. Это
САО, мг/г (реакция с ДФПГ)
Рис. 1. Диаграмма корреляционной зависимости между результатами количественного определения низкомолекулярных АО в различных пищевых и лекарственных растениях, полученными по методу, основанному на взаимодействии АО с радикалом ДФПГ (ось абсцисс), и амперометрическому методу (ось ординат).
0.7
0.6
0.5
D
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.