БИОХИМИЯ, 2006, том 71, вып. 2, с. 190 - 200
УДК 577.216.35
СОДЕРЖАНИЕ И ЛОКАЛИЗАЦИЯ БЕЛКА YB-1 В ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ С МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТЬЮ*
© 2006 г. А.В. Вайман1, Т.П. Стромская1 , Е.Ю. Рыбалкина1, А.В. Сорокин2, С.Г. Гурьянов2, Т.Н. Заботина1, Е.Б. Мечетнер3, Л.П. Овчинников2, А.А. Ставровская1**
1 НИИ канцерогенеза, ГУ Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, 115478Москва, Каширское ш., 24; электронная почта: vaiman@yandex.ru
2 Институт белка РАН, 142290 Пущино Московской обл.; факс: (495)632-7871, электронная почта: ovchinn@vega.protres.ru 3 Chemicon International Inc. 28820 Single Oak Drive, Temecula, CA 92590, USA; E-mail: emechetner@cox.net
Поступила в редакцию 16.07.05 После доработки 06.10.05
Мультифункциональный ядерно-цитоплазматический белок клеток млекопитающих YB-1 является членом семейства ДНК/РНК-связывающих белков с эволюционно консервативным доменом холодового шока. Связываясь с ДНК в клеточном ядре, YB-1 функционирует в качестве фактора транскрипции и регулирует экспрессию генов, содержащих Y-бокс в промоторах и энхансерах, в том числе генов множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) MDR1 и LRP. Было предложено рассматривать ядерную локализацию YB-1 как наиболее ранний и универсальный маркер МЛУ. Мы сравнили содержание мРНК YB-1 и внутриклеточную локализацию YB-1 в шести парах чувствительных и резистентных к противоопухолевым препаратам вариантах линий клеток различных опухолей. Мы нашли, что ни увеличение содержания мРНК YB-1, ни значительное повышение количества клеток с ядерной локализацией YB-1 не являются обязательными признаками резистентных к химиопрепаратам популяций клеток. Однако в резистентных линиях с наиболее высоким содержанием мРНК YB-1 наблюдалось одновременное повышение концентрации мРНК MDR1, MRP1, BCRP, LRP, кодирующих разные белки МЛУ. Увеличение концентрации мРНК YB-1 в результате трансфекции кДНК YB-1 в чувствительные клетки двух разных линий привело к повышению количества мРНК МЛУ MRP1 и LRP. Снижение концентрации мРНК YB-1 путем воздействия малой шпилечной РНК (мшРНК) против мРНК YB-1 на клетки трех разных линий привело к снижению уровня мРНК MRP1, LRP и MDR1, однако эффекты мшРНК/YB-1 в разных клетках различались. Таким образом, наши данные свидетельствуют в пользу того, что YB-1 регулирует активность группы генов МЛУ, однако едва ли может рассматриваться как универсальный маркер уже существующих популяций резистентных к химиопрепаратам клеток. Очевидно, что YB-1 необходим не для поддержания лекарственной устойчивости, а для формирования резистентных клеточных популяций.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: белок YB-1, мРНК, опухолевые клетки, резистентные клетки, локализация белков.
УБ-1 клеток млекопитающих является членом мультифункционального семейства ДНК/ /РНК-связывающих белков с эволюционно консервативным доменом холодового шока [1—4]. В бактериальных клетках члены этого семейства известны как главные белки холодового шока. Бактериальные белки этого семейства [2] и УБ-1 млекопитающих [5] участвуют в
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 05-161, 15.01.2006.
** Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
адаптации клеток к росту при пониженных температурах. УБ-1, связываясь с ДНК, функционирует в качестве фактора транскрипции и регулирует экспрессию генов, содержащих в промоторах и энхансерах У-бокс-элемент, в том числе экспрессию гена главного комплекса гистосовместимости II [6], гена множественной лекарственной устойчивости МВЯ1 [7] и генов циклинов А и Б1 [8]. Наряду с этим УБ-1 участвует в репарации, рекомбинации и репликации ДНК [1]. Взаимодействуя с мРНК, этот белок принимает участие в сплайсинге мРНК в ядре [9, 10], является основным упаковочным
белком для мРНК в цитоплазме [11] и регулирует время жизни [12, 13] и матричную активность мРНК в белковом синтезе [14—20]. Показано, что УБ-1 может повышать устойчивость клеток к действию ионизирующей радиации и химических агентов, повреждающих ДНК [21]. Полагают, что он может претендовать на роль универсального раннего маркера множественной лекарственной устойчивости опухолей [1, 22, 23].
Множественная лекарственная устойчивость опухолевых клеток (МЛУ) является серьезным препятствием на пути химиотерапии злокачественных новообразований. МЛУ — это система защиты популяции опухолевых клеток от множества лекарств, различающихся по химической структуре и механизму действия на клетку [24—26]. Повышенная активность белка МЛУ, Р-гликопротеина (Ряр; АБСБ1), была первым обнаруженным механизмом, определяющим МЛУ. В последующие годы были найдены другие молекулярные механизмы МЛУ, и стало ясно, что лекарственная устойчивость опухолевых клеток — сложный феномен, в основе которого лежит целый ряд молекулярных изменений, и что в одной и той же клетке могут функционировать одновременно несколько механизмов, модулирующих чувствительность опухолей к лечению [26]. Наиболее изученными механизмами, важными для клинической практики, являются: активация трансмембранных белков, выбрасывающих различные химические вещества из клетки, активация ферментов глу-татионовой системы детоксикации и изменения в генах и белках, вовлеченных в контроль апоп-тоза [24, 26].
В феномене МЛУ опухолевых клеток могут играть роль как повышение количества УБ-1 в клетках, так и его перемещение из цитоплазмы в клеточное ядро [1, 23]. В различных опухолях (рак молочной железы, рак легкого, остеосарко-мы и др.) отмечено увеличение количества клеток с ядерной локализацией УБ-1 (по сравнению с нормальными тканями) и корреляция локализации УБ-1 с неблагоприятным течением заболеваний и резистентностью к химиотерапии [22, 27—31]. Показано, что ряд химиотера-певтических препаратов индуцирует перемещение УБ-1 из цитоплазмы в клеточное ядро [7, 21]. Найдено, что повышение содержания УБ-1 в клетках рака молочной железы может приводить к гиперэкспрессии гена МВЯ1, кодирующего Pgp, и к возникновению МЛУ [22]. Однако роль УБ-1 в возникновении и развитии МЛУ остается недостаточно ясной. В частности, отсутствуют систематизированные исследования резистентных опухолевых клеток. Немногочис-
ленные работы, в которых сравнивались отдельные резистентные линии опухолевых клеток с соответствующими клетками дикого типа, показывают, что количество белка УБ-1 повышено в ядрах культивируемых резистентных клеток рака кишечника НСТ15, рака яичников KFr и рака молочной железы MCF-7/ADR по сравнению с их чувствительными вариантами [32, 33]. После введения в культивируемые клетки генетических супрессорных элементов (GSE) и последующего отбора в среде с цитостатиком культура клеток приобретала МЛУ, что сопровождалось увеличением уровня экспрессии мРНК нескольких разных генов: генов, вовлеченных в репарацию и репликацию ДНК, в ответ клеток на стресс, и генов, кодирующих факторы транскрипции, в том числе и УБ-1 [34]. Однако остается неясным, насколько часто связаны гиперэкспрессия и/или ядерная локализация УБ-1 с повышением уровня экспрессии генов и белков МЛУ. А также действительно ли гиперэкспрессия УБ-1 в резистентных опухолевых клетках влияет одновременно на экспрессию нескольких разных генов МЛУ. Эти сведения позволили бы судить о возможности вовлечения УБ-1 в регуляцию сложной, многофакторной МЛУ. Нет данных относительно связи УБ-1 с уровнем резистентности культур опухолевых клеток различного тканевого происхождения. Результаты таких опытов позволили бы оценить, насколько широко УБ-1 участвует в регуляции МЛУ и на каких этапах развития МЛУ необходимо участие УБ-1. Чтобы ответить на эти вопросы, мы исследовали взаимосвязь между содержанием и локализацией УБ-1 и содержанием нескольких мРНК/белков МЛУ, а также с уровнем лекарственной устойчивости клеток в шести парах чувствительных и резистентных клеточных линий различного гистогенеза. Мы показали, что в резистентных линиях разного происхождения количество клеток с локализацией УБ-1 в ядре повышено по сравнению с родительскими чувствительными вариантами, однако это количество может значительно различаться. Содержание мРНК/белка УБ-1 в резистентных вариантах клеток повышено не всегда, и не коррелирует с уровнем лекарственной устойчивости клеток. Повышенное содержание УБ-1 может коррелировать с повышенным содержанием нескольких мРНК/белков МЛУ. Кроме того, мы нашли, что увеличение (в результате стабильной трансфекции клеток конструкцией, содержащей УБ-1) или снижение (под влиянием мшРНК/УБ-1) содержания мРНК УБ-1 сопровождается соответственно либо повышением, либо снижением содержания некоторых мРНК/белков МЛУ.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Линии клеток. Перечень линий клеток, использованных в работе, приведен в таблице [3540]. Клетки культивировали в среде DMEM или RPMI1640 с 10%-ной эмбриональной бычьей сывороткой при 37° и 5%-ном CO2. Резистентные к цитостатикам клетки культивировали после размораживания в течение 2—3 пассажей, добавляя в среду селективный агент. Селективный агент исключали из среды не менее, чем за 2 недели до постановки опытов.
Выделение РНК и ОТ-ПЦР. Выделение тотальной РНК осуществляли при помощи TRI Reagent («Sigma», США) в соответствии с протоколом производителя. Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием случайных праймеров. Для выравнивания количества кДНК в разных образцах амплифицировали гены домашнего хозяйства ß-актина и GAPDH. Использовали следующие специфические прай-меры для амплификации продуктов соответствующей длины (п.н. — пары нуклеотидов):
актин (540 п.н.) GTGGGGCGCCCCAGGCACCA (прямой)
CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC (обратный)
GAPDH (513 п.н.) CCCCTGGCCAAGGTCATC-CATGACAACTTT (прямой) GGCCATGAGGTCCACCACCCTGTTGCTGTA (обратный)
YB-1 (476 п.н.)ACAAGAAGGTCATCGCAAC-GAAG (прямой)
GGTTGGAATACTGTGGTCGACG (обратный)
MDR1 (167 п.н.) CCCATCATTGCAATAGCAGG (прямой)
GTTCAAACTTCTGCTCCTGA (обратный)
MRP1 (180 п.н.) ATCAAGACCGCTGTCATTGG (прямой)
GAGCAAGGATGACTTGCAGG (обратный)
BCRP (172 п.н.) TGCCCAGGACTCAATGCAACAG (прямой)
ACAATTTCAGGTAGGCAATTGTG (обратный)
LRP (405 п.н.) CCCCCATACCA
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.