научная статья по теме СОХРАНЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАН ЯДЕРНЫХ КЛЕТОК КРОВИ ПРИ ТЕМПЕРАТУРЕ –80°С Биология

Текст научной статьи на тему «СОХРАНЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАН ЯДЕРНЫХ КЛЕТОК КРОВИ ПРИ ТЕМПЕРАТУРЕ –80°С»

БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2008, том 25, № 1, с. 18-24

УДК 612.112.9.014.43

СОХРАНЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАН ЯДЕРНЫХ КЛЕТОК КРОВИ ПРИ ТЕМПЕРАТУРЕ -80°С

© 2008 г. Е. П. Сведенцов, Т. В. Туманова, А. Н. Худяков, О. О. Зайцева, О. Н. Соломина,

С. В. Утемов*, Ф. С. Шерстнев*

Институт физиологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук,

167982, Сыктывкар, ул. Первомайская, 50; факс (8212) 44-78-90; электронная почта: office@physiol.komisc.ru *ФГУ Кировский НИИ гематологии и переливания крови Росздрава, 610027, г. Киров, ул. Красноармейская, 72;

факс (8332) 54-97-31; электронная почта: labcon@mail.ru Поступила в редакцию 17.04.2007 г.

После доработки 23.07.2007 г.

Структурно-функциональные изменения в цитоплазматических мембранах и мембранах органелл играют важную роль в повреждении клеток под действием отрицательных температур. Эти изменения могут быть обратимыми, если используется комплекс мер для защиты биологических мембран от повреждений. На примере ядерных клеток крови, как представителей высокодифференцированных клеток, показана возможность сохранения полноценности их мембран при замораживании и длительном хранении в условиях низких температур (-80°C). Наряду с классическим линейным охлаждением клеточной суспензии использован и нетрадиционный подход - экспоненциальный режим охлаждения. Применение разработанного авторами малотоксичного криопротекторного раствора и экспоненциальной программы охлаждения позволяет сохранить через 180 сут (срок наблюдения) холодового анабиоза (-80°C) 91.0 ± 5.1% эозинорезистентных лейкоцитов и 76.7 ± 14.7% нейтрофилов, способных к фагоцитозу. Предложенная криотехнология, включающая использование малотоксичного криопротекторного раствора, экспоненциальной программы замораживания и быстрого отогрева, является доступной, низкозатратной и может быть применена для хранения других клеток животного происхождения.

Ведущая роль в повреждении клетки при воздействии низких температур принадлежит структурно-функциональным изменениям ее цитоплаз-матической мембраны и мембран органелл [1, 2]. Согласно мембранной концепции криоповрежде-ния клетки [3], основным механизмом разрушения мембраны в условиях охлаждения, замораживания и отогрева являются фазовые превращения липи-дов и белков, приводящие к нарушению барьерных свойств мембраны и утечке из цитоплазмы ионов и биомолекул через образующиеся трансмембранные дефекты, что приводит к деформации мембраны, изменению формы клетки и ее лизису. Степень нарушения структуры мембран и фазового состояния липидов отличается при разных температурах и определяется соотношением фосфолипидов насыщенных и ненасыщенных жирных кислот, а также содержанием холестерина. Чем меньше холестерина, тем при более высокой температуре происходит кристаллизация липидов [4]. Асимметричное распределение холестерина в мембране ограничивает миграцию мембранных белков и их агрегацию в белковые домены, что способствует сохранению структурного состояния белков цитоскелета и поддержанию формы и объема клеток.

Формирование и судьба трансмембранных дефектов зависят от условий и способов замораживания. При образовании мелкомасштабных трансмембранных дефектов, соизмеримых с катионной проницаемостью, клетка способна к репарации [3]. Большинство клеток высших растений и животных в процессе эволюции не приобрели естественных механизмов адаптации к холоду, поэтому они нуждаются в средствах "искусственной" защиты от воздействия низких температур, в качестве которых могут выступать криопротекторы. В настоящее время известно более 120 веществ, обладающих криопротекторным действием, однако широкое применение получили единицы из них. В качестве внутриклеточных (способных проникать в клетку) криопротекторов чаще всего используют глицерин, диметилсульфоксид, диметилацетамид, 1.2-пропандиол, защитное действие которых обусловлено тем, что благодаря своей низкой молекулярной массе они легко проникают в клетку, связывают воду, изменяют кристаллообразование, способствуя образованию преимущественно мелких кристаллов льда при замораживании. Эти вещества образуют также связи со структурными компонентами мембраны клеток, что ведет к снижению ее повреждения при замораживании. Кроме того, будучи хорошими растворителями, они

Таблица 1. Технологии, используемые для криоконсервации лейкоцитов при -80°С

Протектор, конечная концентрация Программа Результаты Срок хранения Ссылка

Диметилсульфоксид, от 6 до 15% Линейная, 1°С/мин, до -80°С Жизнеспособность 40% 24 ч J.P. Crowley et al. [11]

Диметилсульфоксид, 5 и 10% Линейная, 2°С/мин, до -80°С Сохранность гранулоцитов 60% (после отмывания 43%) до 3 мес F.J. Lionetti [12]

Диметилсульфоксид, 5% с добавлением 4% раствора гидроксиэтилкрахмала для отмывания клеток Линейная, 2-3°С/мин, до -80°С Жизнеспособность 27%, фагоцитарноактивные нейтрофилы 58% 4 мес P. Boonlayan-goor et al. [13]

Гексаметиленбистетраокси-этилмочевина, 15% Экспоненциальная. 1-й этап: 7-8°С/мин до -3°С; 2-й этап: 1-2°С/мин, до -28°С; 3-й этап: 3-4°С/мин, до -80°С Сохранность гранулоцитов 84%, Фагоцитарноактивные нейтрофилы 44% 12 мес С.В. Утемов [14]

снижают концентрацию солей внутри и вне клеток, тем самым предохраняют их от обезвоживания и повреждения белковых структур. Среди внеклеточных (непроникающих в клетку) криопротекторов широкое распространение получили поливинил-пирролидон и полиэтиленоксид-1500, действие которых направлено на дегидратацию клеток и стабилизацию фракции внеклеточной воды. Применяют также криопротекторы смешанного типа -полиэтиленоксид-400 [3] и гексаметиленбистетра-оксиэтилмочевину [5].

Сохранность клеточной мембраны зависит также от скорости замораживания и отогрева. В настоящее время для замораживания клеток крови и костного мозга наряду с классическими линейными программами применяют и экспоненциальные. Показано, что экспоненциальные, в частности, двухступенчатые программы замораживания клеток костного мозга до сверхнизких температур [5], а также тромбоцитов до умеренно низких [6] обеспечивают такую же эффективность криоконсервации, как и традиционное охлаждение с постоянной скоростью. Экспоненциальные программы наиболее предпочтительны, так как значительно сокращают продолжительность и трудоемкость процедуры замораживания. Она заключается в погружении контейнера с биологическим объектом в криостат с жидким хладоагентом, имеющим фиксированную температуру, а затем после выдержки в течение 10-20 в нем - непосредственно в дьюар с жидким азотом [7]. Финансовые затраты на реализацию низкотемпературной (-80°С) консервации гемопоэтических стволовых клеток по экспоненциальному режиму [8] с применением электрорефрижераторной технологии в 2 раза ниже затрат при замораживании по линейным программам с использованием жидкого азота (-196°С). Это пре-

красная альтернатива для тех учреждений, где нет возможности использовать жидкоазотную технологию. Экспоненциальные программы подтвердили свою эффективность и при замораживании ядерных клеток крови до субумеренно (-20°С) и умеренно низкой (-40°С) температуры [9]. На термограммах не отмечается выброса кристаллизационного тепла - следовательно, не происходит роста кристаллов, вызывающих механическое повреждение мембран, что также положительно сказывается на сохранности клеточной взвеси. При применении указанного режима замораживания отогрев целесообразно проводить быстро, что также позволяет избежать активации процессов рекристаллизации.

Для клинических целей в РФ в настоящее время лейкоциты замораживают до сверхнизкой температуры (-196°С) под защитой разработанного в ГНЦ криоконсервирующего раствора "Лейко-криодмац" на основе зарубежного криопротекто-ра диметилацетамида (в конечной концентрации 5%). При этом срок сохранности клеток составляет 2 г. [10]. Однако не существует метода консервации лейкоцитов при низкой температуре (-80°С), разрешенного к применению в клинической практике, и ведутся разработки таких криотехнологий (табл. 1). Зарубежные авторы с этой целью используют протектор диметилсульфоксид, который при внутривенном введении в конечной концентрации более 5% вызывает тонико-клонические судороги, переходящие в генерализированные, а затем наступает кома [15, 16]. По этой причине требуется отмывание криопротектора от биообъекта перед применением, что снижает жизнеспособность клеток. Используемая отечественными учеными [14] гек-саметиленбистетраоксиэтилмочевина в настоящее время является самым малотоксичным

Температура, °C

Программы замораживания лейкоцитов до -80°С с предложенным нами [18] криопротекторным раствором. 1 - Линейная программа, 2 - экспоненциальная программа.

криопротектором (ЛД50 = 15.5 г/кг массы мыши) и не требует отмывания от клеток перед применением [17]. Таким образом, остается актуальной проблема поиска новых эффективных технологий сохранения ядерных клеток крови в полноценном состоянии при температуре -80°С.

В данной работе предложен вариант решения этой проблемы, который заключается в замораживании лейкоцитов крови человека по экспоненциальному режиму с применением электрорефрижераторной технологии до -80°С под защитой нового малотоксичного криопротекторного раствора [18] и быстром отогреве.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Проведено 32 исследования, включающих более 600 тестирований. Объектом исследований служили лейкоциты крови человека, полученные из цельной донорской крови методом цитафереза на центрифуге "Sorvell" (США). Кровь доноров-добровольцев (средний возраст 35.6 ± 5.0 лет) по 450 мл в полиолефиновых мешках для сбора крови "Teruflex 450-400-400" (США) с 60 мл консерванта CDF (цитратфосфатдекстроза) помещали в центрифужный стакан, избегая образования складок, уравновешивали и центрифугировали c охлаждением в течение 5 мин со скоростью 2500 об/мин. При этом эритроциты осаждались на дно контейнера, над ними располагалась рыхлая лейкоцитарная пленка белого цвета и обогащенная тромбоцитами плазма. Далее контейнер с кровью помещали в плазмоэкстрактор "ПЭК-3" (Россия). Обогащенную тромбоцитами плазму переводили в спаренный мешок, образовавшуюся лейкоцитарную пленк

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком