ИЗВЕСТИЯ РАИ. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2008, № 3, с. 304-312
ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ
УДК 581.142:57.085(571.6)
СОХРАНЕНИЕ ГЕНОФОНДА ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫХ РАСТЕНИЙ МЕТОДОМ КРИОКОНСЕРВАЦИИ СЕМЯН
© 2008 г. А. Б. Холина, Н. М. Воронкова
Биолого-почвенный институт ДВО РАИ, 690022 Владивосток, просп. 100-летия Владивостока, 159
E-mail: kholina@biosoil.ru Поступила в редакцию 20.12.2006 г.
Изучена криоустойчивость семян 103 видов растений 33 семейств из пяти регионов Дальнего Востока России. Показано, что 89.1% изученных видов не снижали жизнеспособности семян в процессе криохра-нения. Для 6 видов вышвлена межпопуляционная изменчивость ответной реакции семян на действие сверхнизких температур (-196°С). Замораживание семян в жидком азоте, вызывающее глубокий анабиоз, может быть использовано в качестве режима их долговременного хранения. Предварительная оценка генетического разнообразия на популяционном уровне позволяет проводить максимально полную мобилизацию генофонда вида. Полученные результаты являются важным этапом при разработке научной основы для создания банка семян дальневосточной дикорастущей полезной флоры с целью сохранения и восстановления природных ресурсов.
Угроза реального исчезновения множества видов растений диктует создание в разных странах Национальных программ по сохранению природных генетических ресурсов. В связи с этим возрастает интерес к банкам зародышевых плазм семян, меристем, пыльцы и культур клеток как единственному средству долговременного хранения геномов и сбережения генетических стандартов культурных и дикорастущих растений (Roos, 1989; Pence, 1991; Rao, 2004; Panis, Lambardi, 2005). Наиболее перспективным режимом хранения семян считается криоконсервация - замораживание в жидком азоте при температуре -196°С, к настоящему времени широко применяемая для хранения семян культивируемых видов (Молодкин, 1984; Jorgensen, 1990; Gonzales-Benito et al., 1997). В отличие от других режимов криоконсервация семян является надежным, простым и экологически чистым методом хранения, поскольку только замораживание в жидком азоте приводит к практически полной остановке метаболизма и обеспечивает длительное хранение семян (Bonner, 1990). Криоконсервация позволяет исключить истощение запасных веществ, накопление токсинов, распад и инактивацию ферментных комплексов, самоокисление липидов (Stanwood, 1985); применение этой технологии снижает до минимума риск генетических и эпигенетических изменений (Bonner, 1990; Panis, Lambardi, 2005). Использование низкотемпературных банков семян позволяет сохранить биологическое разнообразие видов и поддерживать стабильность генотипов, что особенно важно для редких и исчезающих видов. Исследования по изучению влияния глубокого замораживания на жизнеспособность семян дикорастущих растений в нашей стране немногочисленны.
Их обзор представлен в работе Тихоновой (1999). Результаты работ по изучению реакции семян дальневосточных растений на действие сверхнизких температур частично опубликованы нами ранее (Воронкова и др., 2000, 2003; Холина, Воронкова, 2001).
Изучение данного вопроса особенно актуально для обитателей растительных сообществ Дальнего Востока России - представителей прибрежной и горной вулканической растительности, редких, реликтовых, эндемичных и лекарственных растений. Риск исчезновения этих экосистем и составляющих их видов чрезвычайно высок как в силу естественных причин (извержения вулканов, пожары, колебания уровня моря, периодические штормы, оползни и другие катастрофические воздействия), так и антропогенного давления (высокая рекреационная нагрузка и хозяйственная деятельность). Для уникальных ценозов Дальнего Востока, таких как природный парк о-ва Монерон, экосистемы вулканов Курил и Камчатки, важно сохранение генофонда не только отдельных ценных видов, но и наиболее полное представительство сообщества в банке семян. Известно, что общепринятый режим хранения семян при 5°С не является надежным, так как низкие положительные температуры замедляют потерю жизнеспособности, но не обеспечивают долговременного хранения (Яооз, 1989; Николаева и др., 1992). Для семян дальневосточных растений, формирующихся в стрессовых природных, а иногда и антропогенных условиях обитания, вплоть до критических, где довольно часто бывает снижена семенная продуктивность и качество семян, единственно приемлемым режимом хранения является глубокое замораживание семян.
Для того чтобы оценить возможность применения криоконсервации для сохранения генофонда дальневосточных растений, мы исследовали криоустойчивость семян при прямом погружении в жидкий азот.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследования проводили в 1997-2006 гг. Объектами исследования служили семена 103 видов дальневосточных растений из 33 семейств. Семена собирали в 124 природных популяциях на юге Приморского края (18 видов), на Камчатке (30 видов), о-вах Курильской гряды (29 видов), о-вах Сахалине (19 видов) и Монероне (14 видов). После сбора семена хранили до начала опыта в течение 2-4 мес. в лаборатории при 20-25°С (до обретения ими равновесной влажности). Жизнеспособность семян при глубоком замораживании зависит от степени их влажности, поскольку известно, что только в определенном диапазоне ее значений семена могут быть устойчивы к действию сверхнизких температур и сохранять начальные посевные качества. Ортодоксальные семена, с влажностью ниже критической, по сравнению с рекальцитрантными более благополучно переносят замораживание .о^ешеп, 1990; Тихонова, 1999). На данном этапе наших исследований были использованы только ортодоксальные семена, влажность которых находилась в пределах 5-10%.
Глубокое замораживание семян в течение
1 мес. проводили путем непосредственного погружения в жидкий азот. Перед погружением в азот семена заворачивали в алюминиевую фольгу. В контроле семена в течение этого месяца хранили в лаборатории при 20-25°С. Отогревали семена
2 ч при комнатной температуре и ставили на проращивание. Проращивали семена в чашках Петри на влажной фильтровальной бумаге в термостате в условиях естественного освещения (16 ч на свету, 8 ч в темноте). Для большинства исследованных видов данные о типе покоя и режиме проращивания семян отсутствуют, поэтому вначале все семена проращивали при температуре не менее 18°С. Если семена не прорастали, их подвергали либо холодной стратификации при температуре 2-5°С в течение 2-4 мес., либо скарификации (обработке серной кислотой в течение 30, 45 и 60 мин с последующим промыванием в проточной воде), учитывая рекомендации по проращиванию семян близких видов (Николаева и др., 1992). Семена ряда изученных растений подвергали холодной стратификации сразу после размораживания.
Жизнеспособность семян оценивали по лабораторной всхожести, наблюдения за ходом прорастания вели ежесуточно. Всхожесть определяли как отношение числа проросших семян к числу
заложенных на проращивание, выраженное в процентах. Для анализа динамики прорастания учитывали начало прорастания и определяли показатель Т50 - число суток, в течение которых всхожесть достигала 50%. В опыте использовали пробы семян по 50 шт. в 3-кратной повторности (для некоторых видов по 25 шт.). Результаты были обработаны статистически, определены средние значения и их стандартные ошибки. Достоверность различий полученных результатов по вариантам опыта оценивали по критерию Стью-дента при уровне значимости P = 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Полученные экспериментальные данные показали, что семена всех видов при равновесной влажности после глубокого замораживания сохраняют жизнеспособность, но их реакция видо-специфична (таблица). У большинства исследованных видов (74.5%) семена после криоконсервации сохраняют всхожесть на уровне контроля, для части видов (14.6%) жизнеспособность семян достоверно увеличивается. Снижение всхожести после криогенного воздействия наблюдали у 11 видов (10.9% от числа изученных), минимальное падение всхожести отмечено у Hemerocallis esculenta (на 5%), максимальное у Epilobium ceph-alostigma (на 31%), в среднем составляя 16.2 ± ± 7.5%. Следует отметить, что для 4 видов - Car-damine impatiens, Hemerocallis esculenta, Papaver miyabeanum, Plantago lanceolata - всхожесть после криоконсервации, при достоверном снижении от уровня контроля, составляет 80-90%. Количество видов, всхожесть семян которых снижается после криогенного воздействия, варьирует по регионам с увеличением в ряду: Сахалин (5.2%) - Камчатка (10%) - Курилы (10.3%) - Приморье (11.1%) - Мо-нерон (14.3%) (рис. 1).
Известно, что негативное влияние глубокого замораживания на прорастание семян обусловлено рядом факторов, среди которых физические повреждения семян в процессе замораживания-оттаивания, влажность семян, их химический состав (Stanwood, 1985; Jorgensen, 1990; Pita et al., 1998). При этом многие экспериментальные работы показали доминирующее значение состава липидов для устойчивости клеток при замораживании (Stanwood, 1985; Vertucci, 1989; Попов, 1993). Для видов с ортодоксальными семенами установлено, что при одинаково низкой влажности семена с высоким содержанием липидов более чувствительны к криогенному воздействию (Stanwood, 1985; Pence, 1991; Орехова, 2005), что может быть связано с фазовыми переходами липидов при быстром замораживании до сверхнизких температур (Stanwood, 1985; Vertucci, 1989). Для 3 (Cardamine impatiens, Plantago lanceolata, Salicornia europaea) из 11 видов, показавших сни-
Жизнеспособность семян дальневосточных растений после криоконсервации
Семейство Число видов Реакция на криоконсервацию*
Приморье Камчатка Курилы Сахалин Монерон I II III
Apiaceae 1 1
Asteraceae 1 11 3 2 1 15 2 1
Boraginaceae 1 1 2
Brassicaceae 4 3 2 7 1 1
Campanulaceae 1 1
Caryophyllaceae 3 1 4
Colchicaceae 1 1
Chenopodiaceae 3 1 2
Crassulaceae 3 1 2 2
Empetraceae 1 1
Ericaceae 2 1 1 3 1
Fabaceae 4 1 1 6
Grossulariaceae 1 1
Hemerocallidaceae 1 1 1 1
Iridaceae 1 1
Juncaceae 1 1
Juncaginaceae 1 1
Liliaceae 1 1 2
Onagraceae 1 1
Papaveraceae 1
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.