ИЗВЕСТИЯ РАИ. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 200S, № 4, с. 464-470
ФИЗИОЛОГИЯ животных ^^^^^^^^^^^^ И ЧЕЛОВЕКА
УДК 591.339:612.73]:612.741
СОКРАТИТЕЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ АМНИОНА И СЕРДЕЧНЫЙ РИТМ ПРИ ОСТРОЙ ГИПОКСИИ В ЭМБРИОГЕНЕЗЕ ЕВРОПЕЙСКОЙ БОЛОТНОЙ ЧЕРЕПАХИ Emys orbicularis (Reptilia: Emydidae)
© 2008 г. M. В. Нечаева, И. Г. Владимирова
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 119334 Москва, ул. Вавилова, 26 E-mail: mnechaeva2003@yahoo.com Поступила в редакцию 19.11.2007 г.
Исследовали влияние острой гипоксии (10% 02 в течение 30 мин) на частоту ритмических сокращений амниона и частоту сердечных сокращений в эмбриогенезе европейской болотной черепахи в 2-х возрастных группах: в период 30-40 и 60-70% инкубации. В контроле обе величины не отличались между группами. При гипоксии частота сокращений амниона достоверно не изменялась, а частота сердечных сокращений снижалась. Динамика изменения частоты сердечных сокращений при гипоксии зависела от возраста. У зародышей из первой группы частота сердечных сокращений снижалась в среднем на 8% к 10-14-й мин и затем не изменялась; а во второй группе снижалась на 18% к 3-7-й мин и затем на фоне действия гипоксии частично или полностью восстанавливалась. Предполагается, что способность зародыша болотной черепахи восстанавливать частоту сердечных сокращений при острой гипоксии во второй половине эмбриогенеза связана с формированием нейрогу-моральных механизмов регуляции.
Условия, в которых протекает эмбриональное развитие, могут в значительной степени влиять на морфологические, функциональные и поведенческие особенности организма в постэмбриональном онтогенезе (Flores et al., 1994; O'Steen, 1998; Barker, 2000; Drake, Walker, 2004; Gilbert, 2005; Mcmillen, Robinson, 2005). Формирование в период эмбрионального развития механизмов, лежащих в основе данного явления, изучено недостаточно.
У рептилий развитие яиц в природе происходит при колебаниях температуры, влажности и содержания кислорода в окружающем воздухе. Можно предположить, что у зародышей этих животных формируются физиологические механизмы, позволяющие им противостоять воздействиям изменяющихся факторов внешней среды, и, следовательно, они могут использоваться как модель для изучения влияния данных факторов на эмбриональное развитие. Известно, что в эмбриогенезе рептилий часто наблюдаются эпизоды гипоксии разной длительности (Plummer, 1976; Booth, 1998). Таким образом, изучение влияния гипоксии на развитие этих животных представляет значительный интерес для понимания механизмов, лежащих в основе приспособления зародыша к гипоксическим условиям или компенсации их воздействия. Однако исследования влияния гипоксии на развитие рептилий немногочисленны. Было показано, что у черепах хроническая гипоксия может замедлять метаболизм и рост зароды-
шей, а также приводить к повышению гемато-крита и увеличению массы желудочка сердца (Ackerman, 1981; Kam, 1993). Хроническая гипоксия в эмбриогенезе американского аллигатора приводила к уменьшению массы зародышей, увеличению относительной массы сердца, а также к снижению артериального давления и сердечного ритма (Crossley, Altimiras, 2005), повышению ге-матокрита (Warburton et al., 1995) и увеличению плотности сосудов хориоаллантоиса (Corona, Warburton, 2000). При острой гипоксии у аллигатора во второй половине эмбриогенеза наблюдалась брадикардия (Crossley, Altimiras, 2005).
Основными функциональными системами, участвующими в обеспечении зародыша кислородом в эмбриогенезе яйцекладущих амниот, являются хориоаллантоис, через сосуды которого происходит газообмен, а также сердечно-сосудистая система и транспортная система крови, обеспечивающие доставку кислорода к тканям зародыша. Предполагается, что ритмические сокращения амниона также могут влиять на доставку кислорода зародышу за счет перемешивания ам-ниотической жидкости (Nechaeva et al., 2004, 2007). Исследование данных систем на разных стадиях развития при действии гипоксии могут прояснить механизмы ответа на гипоксическое воздействие в эмбриональный период.
Задачей настоящего исследования было изучение эффекта острой гипоксии на ритмические сокращения амниона и сердечный ритм в эмбриоге-
незе европейской болотной черепахи и оценка изменения данного эффекта в процессе эмбрионального развития.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Яйца европейской болотной черепахи Emys orbicularis (L.) (сем. Emydidae, отр. Testudines, кл. Reptilia) были получены от самок, отловленных в природной популяции в окрестностях г. Харькова в мае-июне 2006 г. Время откладки яиц принимали за 0 сут. Яйца инкубировали в пластиковых контейнерах с влажным вермикулитом в лабораторном инкубаторе при постоянной температуре 28 ± 0.5°C. Всего в экспериментах было использовано 23 яйца (3 кладки).
Для регистрации сокращений амниона в яйце использовали механотрон, а для регистрации сердечного ритма использовали цифровую видеокамеру (Panasonik, Япония) (Nechaeva et al., 2007). Яйцо помещали в термостатируемую экспериментальную камеру объемом 175 мл при температуре 28°С, аэрируемую подогретым воздухом. В скорлупе над зародышем вырезали отверстие диаметром около 0.5 см. Датчик механотрона присоединяли к амниону с помощью серфина. Регистрацию и анализ частоты сокращений амниона проводили на компьютере. Поскольку сокращения амниона черепахи очень медленные, частоту сокращений определяли за 10 мин. Частоту сердечных сокращений (ЧСС) оценивали по пульсации крупных сосудов аллантоиса. Регистрацию сокращений амниона и ЧСС проводили одновременно и непрерывно. После манипуляций, связанных с подготовкой яйца к эксперименту, следовал период стабилизации, который составлял 30 мин. После этого проводили регистрацию сокращений амниона и ЧСС в контроле (при аэрации экспериментальной камеры воздухом со скоростью 200 мл/мин) в течение 30 мин. Затем в течение 30 мин через экспериментальную камеру пропускали с такой же скоростью газовую смесь, содержащую 10% O2 и 90% N2. После этого газовую смесь заменяли на воздух и проводили регистрацию в течение 30 мин. Данные воздействия не приводили к гибели животных.
Исследовали 2 возрастные группы: на 19-27-е сут (30-40% инкубации) и 37-43-е сут (60-70% инкубации) при общей средней длительности развития 62 сут. Эти возрастные группы были подобраны таким образом, чтобы значения изучаемых параметров (частота сокращений амниона и ЧСС) не различались между группами в контроле, а исследуемый период отражал развитие в первой и второй половине эмбриогенеза (Nechaeva et al., 2007). После эксперимента зародышей усыпляли, используя анестетик нембутал, взвешивали и определяли стадию развития по таблицам разви-
тия для черепахи Chelydra serpentina (Yntema, 1968).
Данные представлены в виде средних значений с указанием стандартной ошибки измерения. Полученные результаты проанализированы с помощью программы "STATiSTICA 6.0". Для оценки достоверности различий применяли однофактор-ный дисперсионный анализ ANOVA. Различия считали значимыми, если p < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
На 19-27-е сут инкубации зародыши болотной черепахи достигали 16-18-й стадии развития. Их масса находилась в диапазоне от 0.15 до 0.44 г и в среднем составляла 0.25 ± 0.06 г. На 37-43-е сут зародыши достигали 22-23-й стадии развития, а их масса в среднем составляла 2.23 ± 0.21 г, находясь в диапазоне от 1.7 до 2.9 г.
Частота сокращений амниона в контроле не различалась в двух возрастных группах и составляла 4.8 ± 0.4 сокр./10 мин на 19-27-е сут (n = 6) и 5.4 ± 0.5 сокр./10 мин на 37-43-е сут (n = 7). В обеих возрастных группах снижение содержания кислорода до 10% и обратная замена гипоксической смеси на воздух достоверно не изменяли частоту сокращений амниона.
ЧСС у зародышей из двух возрастных групп в контроле достоверно не различалась. Эффект газовой смеси с 10% 02 на ЧСС зародыша черепахи зависел от стадии развития. На ранних стадиях развития (19-27-е сут) гипоксия вызывала достоверное снижение ЧСС в среднем на 7 уд./мин (n = 8; p = 0.044), что составляло 8% от исходного уровня (рис. 1). Обычно эффект наступал на 10-14-й мин и продолжался до конца действия гипоксии. При замене гипоксической газовой смеси на воздух наблюдалось восстановление ЧСС до исходной величины за 10-14 мин. Наблюдались также индивидуальные отличия динамики ответа: так у одного зародыша при действии гипоксии ЧСС не изменялась, а в 2-х случаях после снижения ЧСС наблюдалась тенденция к его восстановлению на фоне гипоксической экспозиции. Примеры типичной динамики изменения ЧСС при действии гипоксии и восстановлении после гипоксии у зародышей на 19-27-е сут представлены на рис. 2а.
На более поздних стадиях развития (37-43-е сут инкубации) при действии гипоксии к 3-7-й мин наблюдалось снижение ЧСС в среднем на 16 уд./мин, что составляло 18% от исходного уровня (n = 9; p = 0.0003) (рис. 1). Затем на фоне продолжающегося действия гипоксии наблюдали частичное или полное восстановление ЧСС. В некоторых случаях ЧСС на фоне действия гипоксии могла превышать значение в контроле. Примеры типичной динамики изменения ЧСС при действии
ЧСС, уд./мин 110 г
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
□ 1 □ 2 □ 3
19-27 37-43
Время инкубации, сут
Рис. 1. Влияние острой гипоксии на частоту сердечных сокращений зародышей черепахи из двух возрастных групп: 1 - воздух (контроль); 2 - гипоксия; 3 - воздух после гипоксии. Высота столбиков соответствует средней арифметической, вертикальные линии - ошибка средней. * - достоверные различия по сравнению с контролем.
гипоксии в этой возрастной группе представлены на рис. 26. После замены гипоксической газовой смеси на воздух величина ЧСС не отличалась от таковой в контроле. В тех случаях, когда не наблюдалось самопроизвольного восстановления ЧСС на фоне действия гипоксии, время его восстановления до контрольного уровня после замены гипоксической смеси на воздух составляло в среднем 3-6 мин (рис. 26).
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Известно, что у черепах развитие яиц обычно происходит в гнездах, расположенных глубоко в почве, где циркуляция воздуха ограничена, и могут проявляться гипоксические условия. Умен
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.