БИОХИМИЯ, 2006, том 71, вып. 7, с. 945 - 953
УДК 577.354
СОКУЛЬТИВИРОВАНИЕ КЛЕТОК-ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ СЕТЧАТКИ (КПС) МЫШИ С КУЛЬТУРОЙ КЛЕТОК ПИГМЕНТНОГО ЭПИТЕЛИЯ СЕТЧАТКИ ВЛИЯЕТ НА ОСОБЕННОСТИ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ КПС*
© 2006 г. И.В. Холоденко1, А.А. Буздин1**, Р.В. Холоденко1, Ю.А. Байбикова1, В.Ф. Сорокин2, В.Н. Ярыгин2, Е.Д. Свердлов1
1 Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10; факс: (495)330-6538, электронная почта: anton@humgen.siobc.ras.ru
2 Российский государственный медицинский университет, 117312 Москва, ул. Островитянова, 1; факс: (495)434-4787, электронная почта: rgmu@rsmu.ru
Поступила в редакцию 14.01.06 После доработки 03.04.06
Мы представляем доказательства того, что сокультивирование клеток-предшественников сетчатки (КПС) с клетками пигментного эпителия сетчатки существенно изменяет стандартные пути дифференцировки КПС in vitro. В частности, при сокультивации КПС теряют способность к спонтанной дифференцировке, демонстрируют увеличение иммунореактивности к маркерному белку нейрональных стволовых клеток нестину в 2,1—2,4 раза, а также 1,6-1,7-кратное увеличение иммунореактивности к родопсину, маркеру фоторецеп-торных клеток палочек. Полученные данные свидетельствуют о влиянии межклеточных взаимодействий на дифференцировку КПС.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: клетки-предшественники сетчатки, пигментный эпителий, дифференцировка стволовых клеток.
У млекопитающих, формирование сетчатки (ретиногенез) происходит в основном в ходе эмбрионального развития и заканчивается через несколько дней после рождения. Дифференцировка клеток сетчатки инициируется во внутреннем слое оптического бокала и волнообразно концентрически протекает до достижения периферических участков сетчатки. Известны семь типов клеток сетчатки: фоторецепторные клетки палочки и колбочки, необходимые соответственно для черно-белого и цветного виде-
Принятые сокращения: КПС — клетки-предшественники сетчатки; КПЭ — клетки пигментного эпителия сетчатки; РК — полностью транс-ретиноевая кислота; bFGF — основной фактор роста фибробластов; TGFa — трансформирующий фактор роста a; NGF — фактор роста нервов; EGF — эпидермальный фактор роста; PDGF — тромбоцитарный фактор роста; NT3 — нейротрофин-3; FCS — телячья фетальная сыворотка; DIL — 1,1'-диоктадецил-3,3,3',3'-тетраметилиндокарбоцианин перхлорат; GFAP — глиальный фибриллярный кислый белок.
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 06-005, 14.05.2006.
** Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
ния; клетки Мюллеровской глии; биполярные, ганглиозные, горизонтальные и амакриновые нейроны, которые получают сигналы фоторе-цепторных клеток, преобразуют их и передают в мозг. Важной отличительной чертой ретиноге-неза у млекопитающих является относительно хронологически фиксированная последовательность событий при дифференцировке различных клеточных типов сетчатки [1]. Сначала дифференцируются ганглиозные и горизонтальные клетки, затем колбочки, амакриновые клетки, палочки, биполярные клетки и, наконец, клетки Мюллеровской глии.
Хотя источники нейрональных стволовых клеток были найдены в мозге представителей многих видов млекопитающих [2], в сетчатках взрослых организмов, по-видимому, совсем не происходит обновления клеточных популяций [3]. Поэтому лечение многих болезней сетчатки потребовало бы использования нейрональных стволовых клеток для замещения поврежденных нейронов или глии [4]. Действительно, на моделях животных такие подходы были эффективны для лечения различных болезней, связанных с нейродегенерацией, таких как болезни Хантин-
гтона и Паркинсона [5—7], а также для борьбы с некоторыми заболеваниями сетчатки [8—10]. Клетки-предшественники сетчатки (КПС) были бы чрезвычайно полезны для лечения многих болезней сетчатки прежде всего из-за своей естественной программы дифференцироваться в любой из вышеперечисленных типов клеток. Некоторые ретинопатии ассоциированы с потерей определенных типов клеток сетчатки [11]. Например, в ходе цитомегаловирусной инфекции во внутреннем слое сетчатки поражаются горизонтальные и биполярные клетки, тогда как амакриновые и ганглиозные клетки инфицируются гораздо реже [12]. Наследственные заболевания сетчатки, связанные с отмиранием фото-рецепторных клеток, включая Retinitis pigmentosa, являются в развитых странах наиболее распространенной причиной слепоты [13]. Направленная дифференцировка КПС в нужный тип клеток сетчатки была бы полезна не только для лечения ретинопатий [14], но и для понимания сложных процессов развития сетчатки, включая межклеточные взаимодействия. Общепризнано, что есть большая разница между дифференцировкой и выживаемостью стволовых клеток in vivo и in vitro [15]. Однако несомненно, что знания, полученные в ходе in vitro экспериментов, будут востребованы при создании новых in vivo модельных систем и методов лечения.
Внимание многих исследовательских групп сейчас сфокусировано на направленной диффе-ренцировке стволовых клеток in vitro. Нам известны две основные стратегии, используемые по отдельности или в комбинации одна с другой: культивирование стволовых клеток в присутствии различных факторов роста/дифференци-ровки и сокультивирование клеток, полученных из различных тканей. Обе стратегии применялись для КПС и дали ряд интересных результатов. Было показано, что КПС могут быть получены из пренатальных или раннепостнатальных сетчаток мышей [16], крыс [17] и людей [18, 19] и могут культивироваться in vitro. В работе [20] недавно показано, что бессывороточные среды могут быть полезны для предотвращения диффе-ренцировки крысиных КПС при культивировании. В работе [21] продемонстрировано, что дифференцировка КПС человека может быть модулирована некоторыми экзогенными факторами роста (basic fibroblast growth factor and transforming growth factor — bFGF и TGFa соответственно). Более того, дифференцировка КПС была зависима от плотности клеточной культуры: гораздо большая доля КПС, выращенных при плотности 104 кл/см2, дифференциирова-лась в клетки фоторецепторного фенотипа по
сравнению с клетками, выращенными при плотностях (3—5) • 104 и 105 кл/см2. При этом наблюдаемый эффект усиливался в 7—8 раз в ответ на добавление факторов роста.
Келли и др. [22] использовали антитела на два фоторецепторных маркерных белка, на реко-верин (который экспрессируется во всех фоторецепторах) и на родопсин (который специфичен для палочек), для исследования эффектов полностью транс-ретиноевой кислоты (РК). Они обнаружили повышение числа клеток, экспрес-сирующих эти маркеры, через 2—8 дней культивирования in vitro. Влияние на дифференцировку фоторецепторов было специфичным, поскольку количество амакриновых клеток, получающихся на той же временной стадии развития, не увеличилось при воздействии РК, а уменьшилось [23].
В 1995 г. Шидло и Тернер показали, что посткультивационная среда неонатальных крысиных КПЭ «увеличила выход, выживаемость, пролиферацию и созреваемость» крысиных КПС [17]. Позднее Шидло и коллегам удалось выделить белок молекулярной массы 67 кДа, секретируе-мый культивируемыми КПЭ, который увеличивал выживаемость КПС [24]. Наконец, недавно в работе Чиу и других было показано, что сокуль-тивирование стволовых клеток костного мозга с КПЭ привело к дифференцировке клеток костного мозга в культуру клеток, показывающих фенотип, схожий с нейрональными клетками сетчатки, включая фенотип фоторецепторов [25].
Цель настоящей работы — изучение эффектов сокультивирования мышиных КПС и КПЭ на фенотип и дифференцировку КПС. Было установлено, что выращивание КПС на фидерном слое КПЭ увеличило число клеток КПС, экспрессирующих нестин, маркерный белок нейроэпителиальных стволовых клеток, в 2—2,5 раза и привело к 1,5—2-кратному повышению продукции родопсина, маркера фоторецепторов палочек. Новым результатом была также потеря КПС способности к спонтанной дифференци-ровке во взрослые нейроны сетчатки при со-культивировании. Кроме того, были исследованы эффекты на дифференцировку мышиных КПС различных факторов роста/дифференци-ровки (bFGF, TGFa, NGF, EGF, PDGF, NT3, РК), а также добавления посткультивационной среды КПЭ.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Лабораторные животные. Все эксперименты на лабораторных животных были предприняты в соответствии с действующим законодательством РФ, а также согласно директиве ЕЭС
86/609/EEC и внутриинститутским постановлениям, следуя букве и духу Хельсинкской декларации. Во всех случаях прилагались усилия для минимизации страданий животных. В работе использовались мыши линии CBA. Дата образования пробки принималась за эмбриональный нулевой день.
Выделение клеток-предшественников сетчатки и клеток пигментного эпителия. Эмбриональные сетчатки выделяли из 14-дневных эмбрионов мыши. Глаза из 15 эмбрионов были выделены и дважды промыты в растворе PBS (стандартная буферная система, ICN, США) при добавлении антибиотиков клафорана (10 мкг/мл) и линкомицина (50 мкг/мл). Нервные ткани сетчатки получали при удалении пигментного эпителия и стекловидного тела. Сетчатки затем нарезали на плоские фрагменты размером ~1 мм2 и инкубировали в 0,25%-ном растворе трипсина («ПанЭко», Россия) в PBS в течение 30 мин при 37° для гомогенизации ткани. Трипсинизацию останавливали добавлением до концентрации 10%-ной телячьей фетальной сыворотки (FCS, «HyClone», США). Клетки дважды промывали в PBS и переносили в среду DMEM/F12 («Sigma», США) с 10%-ным содержанием FCS. Клетки высаживали в шестилуночные полистирольные культуральные чашки («Corning Costar», США) с плотностью 5 • 105 кл/см2. Около 90% клеток выживало. Число выживших клеток определяли с помощью окраски трипановым синим (trypan blue, «Sigma»). КПЭ получали из двух мышей (на седьмой день после рождения). Глазное яблоко выделяли и дважды промывали в 1X PBS с добавлением клафорана (10 мкг/мл) и линкомицина (50 мкг/мл). Пигментный эпителий выделяли согласно методике, предложенной Майер-соном [26]. Плоские фрагменты пигментного эпителия размером ~1 мм2 затем обрабатывали
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.