ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЭМБРИОЛОГИЯ
УДК 581.3:576.5:582.475.4
СОМАТИЧЕСКИЙ ЭМБРИОГЕНЕЗ PINUS PUMILA И ПРОДУКТИВНОСТЬ ЭМБРИОГЕННЫХ ЛИНИЙ ПРИ ДЛИТЕЛЬНОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ IN VITRO
© 2015 г. И. Н. Третьякова, Д. Н. Шуваев
Институт леса им. В.Н. Сукачева СО РАН 660036 Красноярск, Академгородок 50, стр. 28 E-mail: culture@ksc.krasn.ru Поступила в редакцию 07.05.2014 г. Окончательный вариант получен 27.04.2015 г.
Зиготические зародыши и мегагаметофиты Pinus pumila вводили в культуру in vitro на среду 1/2 LV, дополненную регуляторами роста 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой (2,4-Д) и бензиламинопу-рином (6-БАП) с целью индукции соматического эмбриогенеза. Получено четыре длительно про-лиферирующие клеточные линии от двух генотипов. Клеточные линии отличались по числу глобулярных соматических зародышей и массе эмбриогенных каллусов. Мультипликация клеточных линий происходила в результате соматического полиэмбриогенеза через кливаж. На питательной среде для вызревания были получены зрелые соматические зародыши кедрового стланика. Однако соматические зародыши не всех эмбриогенных клеточных линий достигали стадии вызревания. Впервые в культуре in vitro получены регенеранты кедрового стланика.
Ключевые слова: Pinus pumila, зиготические зародыши, мегагаметофиты, соматические зародыши, пролиферирующие эмбриогенные линии, in vitro.
DOI: 10.7868/S0475145015050092
ВВЕДЕНИЕ
Кедровый стланик (Pinus pumila (Pall.) Regel), относящийся к пятихвойным соснам, произрастает на северо-востоке Сибири и занимает обширный ареал от северного Прибайкалья до полуострова Камчатка. Данный вид имеет большое экологическое и хозяйственное значение. Его заросли играют важную фитоценотическую и ландшафтную роль. Семена кедрового стланика являются важным пищевым ресурсом для животных. Однако на большей части своего ареала вид подвергается серьезной угрозе из-за длительных лесных пожаров, мешающих его естественному восстановлению.
Проблемы восстановления популяции кедрового стланика и сохранения его генофонда могут быть решены при помощи метода микроклональ-ного размножения через соматический эмбриогенез. При помощи данного метода можно осуществлять массовое тиражирование данного вида с селекционно-значимыми признаками, проводить отбор в культуре in vitro с применением ДНК-микрочипов, производить трансформацию, а также подвергать полученные эмбриоген-ные линии криоконсервации для создания банка ценных генотипов. Феномен соматического эм-
бриогенеза кедрового стланика может служить не только практическим целям, но и является модельной системой для изучения закономерностей клеточной дифференцировки и реализации мор-фогенетической программы развития в раннем онтогенезе (Lelu,1994; Von Arnold et al., 2002; Park et al., 2006).
К настоящему времени эмбриогенный каллус и соматические зародыши получены у 28 видов рода Pinus (Laine, David, 1990; Salajova et al., 1995; Garin et al., 1998; Lelu et al., 1999; Arya et al., 2000; Klimaszewska, Cyr, 2002; Pullman, Bucalo, 2010; Третьякова и др., 2014), и для более чем половины из них проведена оптимизация условий культивирования, обеспечивающих регенерацию из соматических зародышей растений. Частота инициации эмбриогенного каллуса у большинства изученных видов рода Pinus оказалась невысокой. У P. taeda она колебалась от 2% до 25% (MacKay et al., 2006), у P. strobus от 52.9% (Finer et al., 1989) до 76% (Klimaszewska et al., 2001), у P. pinea от 0.5 до 7.2% (Carneros et al., 2009), у P. pinaster в пределах 15% (Bоrcetche, Paques, 1995). Среди пя-тихвойных сосен индукция соматического эмбриогенеза была описана у Pinus koraiensis (Bozhkov et al., 1997), P. sibirica (Третьякова и др., 2014; Третьякова, Ворошилова, 2014), P. pumila (Носкова
Рис. 1. Кедровый стланик в естественных условиях окрестностей поселка Новая Чара (фото Н.Е. Носковой).
и др., 2012; Tretiakova et al., 2012). Частота инициации эмбриогенного каллуса у P. sibirica и P. pumila была очень низкой и не превышала 0.2—0.5% (Носкова и др., 2012, Третьякова и др., 2014).
В данной статье приводятся результаты биотехнологии получения пролиферирующих эмбриоген-ных клеточных линий кедрового стланика и регене-рантов, а также анализ продуктивности полученных эмбриогенных культур в процессе длительного культивирования in vitro.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Объектом исследования служили семяна 80— 100-летних деревьев кедрового стланика, произрастающих в естественных условиях в окрестностях поселка Новая Чара (отроги Удоканского хребта, юго-восточная экспозиция, 56°46' с.ш. и 118°16' в.д., 807 м над уровнем моря), в окрестностях озера Леприндо (56°37' с.ш. и 117°33' в.д., 986 м над уровнем моря) и в Якутии, Алданский район (Алданское нагорье, 58°37' с.ш. и 125°24' в.д.) (рис. 1).
Семена кедрового стланика у 25 деревьев из окрестностей Новой Чары и 10 деревьев озера Леприндо были собраны в 2010 году (первая декада июля) и у 20 деревьев из Якутии в 2012 году (третья декада июля).
Индукция эмбриогенного каллуса
В качестве эксплантов для индукции эмбриогенного каллуса использовали зиготические зародыши на стадии развития семядолей и мегагаме-тофиты вместе с зиготическими зародышами на стадии глобулы. Стерилизацию посадочного материала проводили в два этапа. Первый этап заключался в поверхностной обработке семян раствором перманганата калия (0.3%) в течение 5 мин с последующей промывкой водопроводной водой, затем следовало извлечение мегагаметофитов с зародышами из семенной кожуры. Мегагаметофиты с зародышами стерилизовали в 3%-м спиртовом растворе йода в течение 5 мин с последующей 3-х кратной промывкой в стерильной дистиллированной воде. Для культуры зародышей из тканей мегага-метофитов семян стерильными инструментами извлекали зародыши. Зиготические зародыши и мегагаметофиты высаживали на поверхность ага-ризованной питательной среды для инициации 1/2ЬУ1 (Ыуае е! а1., 1985), которая отличалась от базовой питательной среды ЬУ сниженным в два раза содержанием макроэлементов. В питательную среду добавляли сахарозу (30 г/л), глютамин (500 мг/л), аскорбиновую кислоту (500 мг/л), агар (7 г/л), регуляторы роста: 2,4-Д (2 мг/л) и 6-БАП(1 мг/л). Работы проводили в стерильных условиях лами-
Типы модификации питательной среды 1/2ЬУ4, использованных для вызревания соматических зародышей
Концентрация АБК в среде, мкмоль/л
30
60
120
200
Полиэтиленгликоль, г/л
50
100 50 100 50 100 50
100
Сахароза, г/л
60
нар-бокса. Культивирование осуществляли в темноте в условиях термостата при температуре 23—25°С.
Пролиферация эмбрионально-суспензорной массы (ЭСМ)
Для пролиферации ЭСМ использовали среду 1/2ЬУ2, которая отличалась от базовой индукционной среды 1/21УХ сниженным содержанием гормональных регуляторов роста (в 2 раза), сахарозы (20 г/л) и аскорбиновой кислоты (300 мг/л). Культивирование проводили в темноте в условиях термостата при температуре 23—25°С. Пересадки на свежие питательные среды осуществляли каждые 2 недели.
Оценку прироста каллусной массы на питательной среде для пролиферации проводили путем измерения объема каллуса по формуле V = 2/3пSLh, где V — объем каллуса, мм3; п — 3.14; S— ширина каллуса, мм; L — длина каллуса, мм; h — высота каллуса, мм (Белоруссова, Третьякова, 2008).
Предобработка ЭСМ на жидкой и агаризованной безгормональной питательной среде
Предобработку на жидкой питательной среде без гормонов (суспензионная культура) 1/2ЬУ3Ь осуществляли путем перенесения фиксированного количества ЭСМ в колбы с 50 мл питательной среды. Культивирование суспензионных культур проводили на круговой качалке (60 об./мин.) в темноте в течение 4-х сут при температуре 23—25°С.
Предобработку ЭСМ на твердой (агаризованной) питательной среде 1/2ЬУ38 проводили путем переноса ЭСМ в чашки Петри с последующим распределением ЭСМ по поверхности среды стерильным шпателем. Эта процедура обеспечивала большую поверхность контакта эмбриональных тканей со средой, создавая, тем самым, условия для лучшей очистки культуры от гормональных регуляторов роста. Культивирование ЭСМ на твердой безгормональной питательной среде проводили в темноте в течение 14 сут при температуре 23—25°С.
Вызревание соматических зародышей
Эксперименты по вызреванию соматических зародышей проводили на агаризованных питательных средах 1/2ЬУ4 с добавлением осмотических агентов (полиэтиленгликоль, сахароза) и различных концентраций АБК (таблица).
Из жидкой безгормональной питательной среды пересадку на среду для вызревания осуществляли при помощи фильтрации суспензии через стерильные фильтры, которые помещали в воронку Бюхнера, соответствующего диаметра. Наливали в воронку 25 мл суспензии и откачивали жидкую фракцию с помощью отсасывателя медицинского ОМ-1. После фильтрации, фильтровальную бумагу с осадком ЭСМ переносили на поверхность питательной среды для вызревания.
Последовательность действий при пересадке ЭСМ из твердой безгормональной среды на среду для вызревания была такой же, как и при субкультивировании из среды для пролиферации на твердую безгормональную питательную среду.
Прорастание соматических зародышей и высадка регенерантов в почвенную смесь
Для прорастания соматических зародышей кедрового стланика использовали агаризирован-ную питательную среду 1/4ЬУ5. Из питательной среды 1/2ЬУ1 были исключены: гидролизат казеина, Ь-глютамин, витамины (тиамин, пиридоксин, никотиновая кислота), сахароза и гормональные регуляторы роста. Прорастание соматических зародышей проводили при 16-ти часовом фотопериоде при 23—25°С. Соматические проростки, которые образовывали корни, считали проросшими и высаживали в почвенную смесь (вермикулит и торф в соотношении 1 : 1).
Цитологический анализ
Для проведения цитологического анализа использовали давленые препараты. Экспланты весом 50 мг помещали на предметное стекло и 1— 2 мин выдерживали в красителе (сафранин и гематоксилин). Далее добавляли глицерин, и накрывали препарат покровным стеклом. Опреде-
3500
3000
и
о о
Ч
й 2000
Время культивирования, сут Рис. 2. Рост каллусных культур кедрового стланика А — в жидкой среде, Б — на твердой среде (культура зародыше
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.