ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2013, том 449, № 6, с. 725-728
= ФИЗИОЛОГИЯ =
УДК 612.821.7+577.15/.17
СОМНОГЕННЫЙ ЭФФЕКТ ЭКЗОГЕННОГО БЕЛКА ТЕПЛОВОГО ШОКА 70 кДа РЕАЛИЗУЕТСЯ ЧЕРЕЗ ГАМК(А)-РЕЦЕПТОРЫ В ПРЕОПТИЧЕСКОЙ ОБЛАСТИ ГИПОТАЛАМУСА © 2013 г. И. В. Екимова
Представлено академиком Н.П. Весёлкиным 05.04.2012 г. Поступило 12.04.2012 г.
Б01: 10.7868/80869565213120232
Белки теплового шока 70 кДа (Шр70) — молекулярные шапероны — являются основными компонентами системы контроля качества клеточного протеома и необходимы всем организмам для корректного фолдинга вновь синтезированных белков, внутриклеточного транспорта и "ремонта" белков [1]. В последнее десятилетие после выделения природного и рекомбинантного Шр70 получены принципиально важные данные, указывающие на широкий спектр защитных эффектов Шр70 при социально значимых заболеваниях (злокачественные образования, эндотоксемия, эпилепсия, нейродегенеративные заболевания и др.) и на его участие в молекулярных механизмах модуляции сна [1—4]. У теплокровных животных (крысы, голуби) микроинъекции Шр70 в ликвор третьего желудочка мозга вызывают в нестрессовых условиях увеличение "естественного" медленного сна (МС) [3], а в период реабилитации после стресса — усиление стресс-лимитирующей функции МС [5]. Однако центральные механизмы реализации сомногенного эффекта Шр70 до конца не выяснены. Несколько лет тому назад мы показали, что Шр70 способен преодолевать ликвороэнцефалический барьер и проникать в ГАМК-ергические нейроны "центра" МС — вент-ро-латеральную преоптическую область (ВЛПО) гипоталамуса и других структур мозга [2]. Выяснено, что предварительное введение антагониста ГАМК(А)-рецепторов бикукуллина в ликвор третьего желудочка мозга вызывает у крыс отставленное во времени угнетение сомногенного эффекта препарата Шр70 [4]. Известно, что ГАМК-ергиче-ские популяции нейронов ВЛПО и ГАМК(А)-ре-цепторы этой области играют ключевую роль в механизмах генерации и поддержания МС у теплокровных животных [6—9]. Высказана гипотеза:
Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова
Российской Академии наук, Санкт-Петербург
сомногенный механизм действия препарата Hsp70 обусловлен его модулирующим влиянием на ГАМК-связанные процессы в центре МС — ВЛПО. С целью проверки этой гипотезы в настоящей работе мы изучали роль ГАМК(А)-рецепторов в ВЛПО гипоталамуса в механизмах реализации сомно-генного действия Hsp70 у голубей.
В работе впервые установлено, что препарат основного шаперона Hsp70 вызывает сон, близкий к физиологическому, с участием ГАМК(А)-рецепто-ров в ВЛПО: предшествующее введение в ВЛПО антагониста ГАМК(А)-рецепторов бикукуллина угнетает Шр70-индуцированный МС и увеличивает представленность бодрствования у голубей. Предполагается, что сомногенный эффект белка Hsp70 обусловлен вовлечением Hsp70 в молекулярные механизмы поддержания тормозного сигнала ГАМК в ЦНС и осуществляется путем ГАМК(А)-опосредованного растормаживания "сон-позитивных" нейронов в ВЛПО. Результаты работы имеют приоритетный характер и представляют значительный интерес для создания новых терапевтических технологий лечения инсомнии.
Исследование выполнено на 6 голубях (Columba livia) в условиях свободного поведения при температуре окружающей среды 24—25°С и фотопериоде 12 : 12; пищу и воду давали без ограничений. Методики проведения операции, компьютерной регистрации (в течение 6—8 ч) с помощью системы SASR 8800 (США) и анализа (с эпохой 1 с) электроэнцефалограммы, электроокулограммы, электро-миограммы описаны ранее [8]. В опытах использовали препарат Hsp70, состоящий из индуци-бельной и конститутивной изоформ Hsp70 в соотношении 3 : 1, полученный в лаборатории защитных механизмов клетки Института цитологии РАН. Белок Hsp70 выделяли из тканевых ли-затов красных волокон тазобедренной мышцы быка с использованием комбинации хроматогра-фических процедур [2]. Для очистки от контами-нантов Hsp70 пропускали через колонку с поли-
726
ЕКИМОВА
п в
а 'Ч i .'Л« нг .
ОВР, %
100 г
Бодрствование
г> •' < ■ Я ■ Л
г/ч • ■? • | ■ ■ ' ■■ ■ -4
' • Л" I (
'-■Г ffi, - f л Г ' IV; '"У
Л': 'Л " Я . . V'1 * ■
< >'•>' ■ .Я I, А ■ 1,- ■
i^v-S - ,, £ ■ ■ .
■ ¿{, I1 .4« -ь- ФБ
л. ***### -•- Hsp70
1% * л 80 _ \ -о- bicuculline + ь ФБ
1" • V ' ** \**### -о- bicuculline + ь Hsp70
■ г
: Л :
Vr;;
3-й
ж. м.^'
Л- Ч- 1 ^
■ ВЛП°1
Рис. 1. Гистологический контроль места локализации в вентро-латеральной преоптической области гипоталамуса микроинъекции антагониста ГАМК(А)-ре-цепторов бикукуллина у голубя С. 1ша. Стрелочками обозначено место микроинъекций. Фронтальные срезы головного мозга окрашены толуидиновым синим по методу Ниссля. ВЛПО — вентро-латеральная преоптическая область гипоталамуса, 3-й ж.м. — третий желудочек мозга.
миксин В-агарозным гелем ("Sigma", США). В опытах Hsp70 (1.5 мкг/1 мкл) вводили через проводящую канюлю в третий желудочек мозга за 5 мин до наступления темной фазы суток; контрольным животным вводили растворитель (фосфатный буфер pH 7.4). Микроинъекции антагониста ГАМК(А)-рецепторов бикукуллина (1 мкг/0.2 мкл) ("Sigma") выполнены билатерально в ВЛПО гипоталамуса (координаты по атласу [10]: 8.75 мм ростральнее от нулевой точки, 1.5 мм латеральнее от средней линии черепа и 10.5 мм ниже поверхности черепа) за 15 мин до введения в третий желудочек мозга препарата Hsp70 или его растворителя. В конце экспериментов проводили морфологический контроль места микроинъекций (рис. 1). Результаты исследования обработаны с использованием двухфазного дисперсионного анализа ANOVA. Различия считались достоверными при р < 0.05.
Выяснено, что микроинъекции Hsp70 в третий желудочек мозга вызывают у голубей увеличение периодов неподвижности и более раннее появление (в среднем через 10 мин) эпизодов МС, чем в контроле (в среднем через 15.8 мин). При анализе временных характеристик состояний бодрствования и сна обнаружено уменьшение общего времени бодрствования, увеличение времени МС в течение первых пяти часов с момента введения Hsp70 (рис. 2, 3а), а также явная тенденция к уменьшению квоты быстрого сна со 2-го по 5-й
60
40
20
**###
4 5 Время, ч
Рис. 2. Пробуждающий эффект бикукуллина при введении в ликвор третьего желудочка мозга препарата №р70. Здесь и на рис. 3: ОВР — общее время регистрации; ФБ — микроинъекции фосфатного буфера в третий желудочек мозга (контроль); №р70 — микроинъекции №р70 в третий желудочек мозга; Ыси-сиШпе + ФБ — сочетанное введение бикукуллина в вентро-латеральную преоптическую область гипоталамуса и фосфатного буфера в третий желудочек мозга; ЫсисиШпе + №р70 — сочетанное введение бикукуллина в ВЛПО и №р70 в третий желудочек мозга. Значения достоверны по отношению к контролю: *р < 0.05, **р < 0.01, ***р < 0.001; по отношению к эффекту №р70 #р < 0.05, ##р < 0.01, ###р < 0.001.
час (рис. 3б). Увеличение представленности МС (на 14%, р < 0.01) со 2-го по 5-й час обусловлено исключительно увеличением длительности его эпизодов (на 29 с,р < 0.05), что указывает на связь сомногенного эффекта Шр70 с активацией механизмов поддержания МС.
Микроинъекции антагониста ГАМК(А)-рецепторов бикукуллина в ВЛПО гипоталамуса оказывают пробуждающий эффект у голубей в течение первого часа после введения. Об этом свидетельствуют увеличение общего времени бодрствования (на 24.6%, р < 0.01) и снижение общего времени МС (на 22%, р < 0.01) по сравнению с контролем (рис. 2, рис. 3а). Возрастание длительности эпизодов бодрствования (на 95 с,р < 0.05) и уменьшение в 1.4 раза (р < 0.05) числа эпизодов МС и быстрого сна указывают на активацию би-кукуллином механизмов, направленных на поддержание бодрствования и угнетение запуска сна.
Предварительное введение бикукуллина в ВЛПО сопровождается угнетением сомногенного действия препарата Шр70 и значительным уве-
0
СОМНОГЕННЫИ ЭФФЕКТ ЭКЗОГЕННОГО БЕЛКА ТЕПЛОВОГО ШОКА
727
ОВР, %
100
80
60
40 -
20
1 2 3 4 5 Время, ч
ОВР, % 5
2 -
^— 0
12345 Время, ч
Рис. 3. Влияние бикукуллина на №р70-индуцированный медленный сон (а) и быстрый сон (б).
4
3
1
0
личением времени бодрствования (рис. 2, рис. 3а). Выяснено, что угнетение всего сна (МС + быстрый сон) и увеличение времени бодрствования наиболее выражено в течение первых трех часов с момента введения бикукуллина. В последующие 4-й и 5-й ч пробуждающее действие бикукуллина ослабевает, что, вероятно, связано с его метаболизмом (период полураспада бикукуллина составляет 5—6 ч) (рис. 2, 3). В среднем за 5 ч в сравнении с эффектом Шр70 общее время бодрствования возрастает на 43.4% (р <
< 0.001) и связано это с увеличением как числа, так и длительности его эпизодов. Представленность МС в среднем за 5 ч уменьшается на 46% (р < <0.01), за счет сокращения числа эпизодов — в 1.3 раза (р < 0.05) и их длительности на 45 с (р <
< 0.05), а время быстрого сна — в 2 раза (р < 0.05), преимущественно за счет сокращения числа эпизодов в 2.5 раза (р < 0.05). Значительное снижение квот МС и быстрого сна и преобладание бодрствования при введении в ВЛПО бикукуллина указывают, что сомногенный эффект белка Шр70 опосредуется ГАМК(А)-рецепторами в ВЛПО.
Согласно современным представлениям, ВЛПО является "центром" контроля МС. Экспрессия с^о8-белка (раннего маркёра нейро-нальной активности) значительно возрастает в ВЛПО после МС и не изменяется после бодрствования у различных представителей млекопитающих [11]. Эти данные согласуются с увеличением электрической активности нейронов ВЛПО во время сна, особенно во время глубокого МС у крыс [12] и с развитием длительной инсомнии при химическом выключении нейронов этой области у крыс и голубей [6, 8]. Более половины нейро-
нов (60—80%) преоптической области гипоталамуса крыс и голубей экспрессируют ГАМК [6, 13]. Повышение активности "сон-позитивных" ГАМК-ерги-ческих нейронов ВЛПО вызывает инактивацию нейронных сетей бодрствования и наступление МС [6]. Примечательно, что ГАМК(А)-рецепторы этой области вовлечены в растормаживание сон-позитивных нейронов ВЛПО у крыс [7] и голубей [8]: введение агониста ГАМК(А)-рецепторов мусцимола в ВЛПО вызывает МС, а антагониста бикукуллина
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.