научная статья по теме СОНОСЕНСИБИЛИЗИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ ТЕРАФТАЛА В БАКТЕРИАЛЬНЫХ СРЕДАХ Биология

Текст научной статьи на тему «СОНОСЕНСИБИЛИЗИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ ТЕРАФТАЛА В БАКТЕРИАЛЬНЫХ СРЕДАХ»

БИОФИЗИКА, 2015, том 60, вып. 3, с. 525-529

== БИОФИЗИКА КЛЕТКИ= ==

УДК 548.535.

СОНОСЕНСИБИЛИЗИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ ТЕРАФТАЛА В БАКТЕРИАЛЬНЫХ CPЕДАХ

© 2015 г. С.Е. Мазина, А.В. Гопин, А.Л. Николаев, П.И. Тальберг*

Xимический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова,

119991, Москва, Ленинские горы, 1/3;

*Городская поликлиника № 19 Департамента здравоохранения г. Москвы, 109451, Москва, ул. Верхние поля, 34/4

E-mail: сопорНуШт@тай.гы

Поступила в p едакцию 09.10.14 г.

На бактериальных модельных системах показано, что введение в среду pастворимого соединения - натриевой соли октакарбоксифталоцианина кобальта (терафтала) - приводит в ультразвуковом поле к уменьшению доли выживших бактерий. Высказано предположение, что терафтал в бактериальной среде образует твердую фазу, которая в ультразвуковом поле вызывает деструкцию примыкающих к нанокристаллам структур вследствие локализованных кавитационных процессов.

Ключевые слова: ультразвук, бактерии, соносенсибилизация.

В последние годы большое внимание уделяется исследованию проблемы локализации акустической энергии в биологических системах на искусственно созданных неоднородностях. Такой интерес объясняется реальной возможностью практического применения этого явления в различных областях медицины, в частности, в методе сонодинамической терапии онкологических заболеваний [1-4]. Проведенные на модельных объектах эксперименты свидетельствуют о том, что введение твердофазных модификаторов (соносенсибилизаторов) в полимерную гидрогелевую матрицу приводит в ультразвуковом поле к локальному повышению температур ы [5]. Возможность селективного накопления соносенсибилизатора, пр и наличии физико-химических особенностей выбранного участка (локуса), обеспечивает избирательность несфокусированного ультразвукового воздействия преимущественно в месте локализации со -носенсибилизатора. Это дает основание предположить, что введение твердофазных неодно-родностей в биологическую систему существенно изменит ее отклик на ультразвуковое воздействие. П р и этом агрегаты соносенсибилиза-торов являются своеобразными физико-химическими концентраторами акустической энергии. Вариацией режимов акустического воздействия и размер ов частиц твердофазных соно-сенсибилизаторов можно вызвать либо обратимое изменение примыкающих к нанокристал-лам структур, либо полную их деструкцию. Первый вариант дает возможность использо-

вать твердофазное модифицир ование полимерных структур для конструирования лекарственных контейнеров с управляемым ультразвуком выходом лекарственного вещества [6], второй используется в сонодинамической терапии онкологических заболеваний [7].

В экспериментах с гелевыми системами показано, что интенсивность кавитационных шумов, возникающих в модифицированых гелях при ультразвуковом воздействии, превышает аналогичную для немодифицированного образца более чем в пять р аз. Усиление деструкци-онных процессов в присутствии твердофазного модификатора - фталоцианина железа - обнаружено по изменению молекулярно-массового распределения полимера, подвергнутого ультразвуковому воздействию [8]. Целью данной работы была оценка на бактериальных модельных системах изменения отклика на ультразвуковое воздействие, вызванное введением в эти системы октакарбоксифталоцианина кобальта (терафтал) - соносенсибилизатора, используемого в доклинической и клинической пр актике ультразвуковой тер апии онкозаболеваний. Бактерии, в определенном приближении, могут рассматриваться в качестве биологических моделей структурных элементов злокачественных опухолей. Поэтому результаты такого исследования могут быть использованы пр и выборе со -носенсибилизаторов и оптимальных режимов в ультразвуковой терапии онкологических заболеваний.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальная модель. В качестве объектов исследования были выбраны бактерии Escherichia coli (Enterobacteriaceae), которые являются постоянным компонентом кишечной микро -флоры, и бактерии Enterococcus spp., также приспособленные к существованию в организме человека. Культур у E. coli выращивали на ср еде Мас Conkey, культуру Enteroccocus spp. - на среде PCA (Standard Methods agar) в чашках Петри пр и 37°C. Эксперименты с ультразвуковым воздействием проводили на суспензии микроорганизмов. Для приготовления суспензии бактериальные клетки смывали с поверхности ср еды физиологическим р аствором с рН 7,1. Концентр ация бактерий в суспензии составляла 2000-4000 клеток на 1 мл рабочего раствора.

Модификатор. В качестве модификатора использовали тер афтал. Терафтал (ГНЦ НИОПИК, Россия) является эффективным со -носенсибилизатором в методе сонодинамиче-ской терапии онкологических заболеваний [9] и хорошо растворим в воде. Его кальциевые соли и кислые фор мы нерастворимы. В выбранных условиях он не проявляет токсичности в отношении бактерий Escherichia coli и Ente-rococcus spp.

Оценка воздействия ультразвука на суспензию бактерий. В суспензию бактерий добавляли терафтал в концентрации 10-4, 10-5, 10-6 М, время инкубации составляло 10 мин. После инкубации суспензию обрабатывали ультразвуком в течение 10 мин. Ультразвуковую обработку проводили в термостатируемой ячейке при температуре 37°C. Объект располагали на расстоянии 1 см от излучателя (ближнее поле), частота 0,88 МГц, интенсивность воздействия вар ьировали в интервале 1-3 Вт/см2.

Эффективность ультразвукового воздействия оценивали по числу клеток, выживших после этого воздействия, используя принцип Коха, - способность каждой бактериальной клетки образовывать колонию на гелевой среде. ^-поставляли количества колониеобразующих единиц бактерий у следующих обр азцов - контрольная суспензия (без обработки), суспензия после обр аботки ультразвуком, суспензия с добавлением терафтала и суспензия с добавлением терафтала, обработанная ультразвуком. Для этого из каждого обр азца отбирали стандартную пробу (1 мл), которую переносили на среду для культивирования микроорганизмов в чашку Петри. Чашки с бактериями термостатировали при 37°C в течение суток, после чего пр оизво-дили подсчет выросших колоний. Итоговый результат воздействия оценивали в процентном

соотношении количества колониеобразующих единиц бактер ий контр оль/опыт.

Оценка сорбции терафтала на бактериальных клетках. Была пр оведена оценка со рбци-онной способности бактер ий Escherichia coli по отношению к терафталу. Для этого в 3 мл суспензии бактерий с концентрацией бактериальных клеток 16-106 в 0,9%-м водном ра створе NaCl вносили 15 и 30 мкл раствора терафтала с концентрацией 10-3 М (концентрация терафтала составляла 5-10-6 и 10-5 М соответственно). Аналогично готовили суспензию бактерий, не содержащую терафтал. Полученные суспензии помещали в термостат (температура 37°C) и инкубировали 10 мин. Затем суспензии центрифугировали и центрифугат фотометрировали (длина волны 680 нм) относительно образца, не содержащего терафтал (0,9%-го водного раствора NaCl).

Сканирующая электронная микроскопия.

Изменение морфологии поверхности бактерий исследовали с помощью сканирующего электронного микроскопа. Для фиксации жидкую суспензию бактерий переносили на мембранные фильтры или вырезали участки геля с нанесенными на поверхность бактериями. Фиксацию проводили в жидком пропане в течение 30 с, затем переносили образцы в охлажденный до -78°C ацетон, температуру ацетона повышали до комнатной в течение 2 ч.

Материал высушивали в вакууме в установке сушки в кр итической точке (HSP-2, НкасЫ, Япония), в атмосфере C О2, напыляли золотом (толщина слоя составляла 20 нм) в ионно-на-пылительной установке IB-3 (EIKO). Далее его просматривали в электронном микроскопе S-405A (НкасЫ, Япония) при ускоряющем напряжении 15 кВ.

Трансмиссионная электронная микроскопия.

Ультр аструктуру бактер иальных клеток оценивали методом трансмиссионной микроскопии. Cуспензию клеток центрифугировали, добиваясь осаждения клеток перед каждой сменой раствора.

Фиксацию клеток из контроля после обработки ультразвуком (частота 0,88 Мгц, интенсивность 1 Вт/см2, время воздействия 10 мин) и тер афталом (10-5 М, вр емя контакта с тераф-талом 10 мин) производили 2%-м раствором глутарового альдегида на 0,05 М фосфатном буфере, далее до фиксировали 1%-м раствором четырехокиси осмия. Начальное обезвоживание проводили в серии спиртов восходящей концентрации до абсолютного, с дополнительным контрастированием уранилацетатом в 70%-м спир те (сутки), и заливали в эпоксидные смолы.

C ОНОСЕН СИБИЛИЗИРУЮЩЕЕ ДЕЙ C ТВИЕ ТЕРАФТАЛА

527

Рис. 1. Зависимости доли выживших клеток (N/N0) Enterococcus spp. после облучения ультразвуком от интенсивности воздействия в водной среде: 1 -ультразвук, 2 - ультразвук совместно с терафталом (10-4 М), 3 - ультр азвук совместно с тер афталом (10-5 М), 4 - ультр азвук совместно с тер афталом (10-6 М).

P ис. 2. Доля выживших бактер иальных клеток Escherichia coli после совместного действия ультразвука и тер афтала в водной ср еде: 1 - ультр азвук,

2 - ультр азвук совместно с тер афталом (10-4 М),

3 - ультр азвук совместно с тер афталом (10-5 М),

4 - ультр азвук совместно с тер афталом (10-6 М).

Срезы контрастировали по Рейнолдсу и затем пр о сматр ивали в электр онном микр о скопе ТЕМ 1ео1 (Япония).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Ультр азвуковое воздействие оказывало влияние на жизнеспособность бактер ий, пр ичем число выживших бактер ий уменьшало сь по мер е увеличения мощности ультр азвука. Введение в суспензию тер афтала снижало долю выживших бактер ий, и это уменьшение имело до ста-точно четко выраженную концентрационную зависимость (р ис. 1, 2). Заметный и во спр оиз-водимый эффект влияния тер афтала на умень -шение числа выживших клеток в ультр азвуко-вом поле наблюдался пр и интенсивностях ульт -р азвукового воздействия 1-5 Вт/см2. П р и этом концентр ация тер афтала находилась в пр еделах 10-4-10-5 М. Воздей ствие меньшей акустической мощности пр актически не отр ажалось на жизнеспособности клеток, а при большей мощности влияние тер афтала пер еставало быть заметным.

Из приведенных данных следует, что введение тер афтала уменьшает долю выживших бак

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком