научная статья по теме СООБЩЕСТВА СУЛЬФАТРЕДУЦИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ В ВОДНОЙ ТОЛЩЕ ГДАНЬСКОЙ ВПАДИНЫ БАЛТИЙСКОГО МОРЯ Биология

Текст научной статьи на тему «СООБЩЕСТВА СУЛЬФАТРЕДУЦИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ В ВОДНОЙ ТОЛЩЕ ГДАНЬСКОЙ ВПАДИНЫ БАЛТИЙСКОГО МОРЯ»

МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 84, № 2, с. 250-260

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

УДК 579.2.08

СООБЩЕСТВА СУЛЬФАТРЕДУЦИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ В ВОДНОЙ ТОЛЩЕ ГДАНЬСКОЙ ВПАДИНЫ БАЛТИЙСКОГО МОРЯ

© 2015 г. В. А. Корнеева*, **, Н. В. Пименов**, 1, А. В. Крек***, Т. П. Турова*, **, А. Л. Брюханов*, **

*Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, биологический факультет, каф. микробиологии **Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук, Москва ***Балтийский федеральный университет им. Иммануила Канта, Калининград Поступила в редакцию 07.07.2014 г.

Методом ПЦР с праймерами на гены 168 рРНК шести основных филогенетических подгрупп суль-фатредуцирующих бактерий (СРБ) проведен анализ разнообразия сообществ СРБ, обитающих в водной толще глубоководной зоны Гданьской впадины Балтийского моря, где в придонных водах наблюдалось присутствие Н28. С использованием денатурирующего градиентного гель-электрофореза с последующим секвенированием определены нуклеотидные последовательности реамплифи-цированных участков гена dsrB в исследуемых водных пробах. Впервые во всех исследованных гидрохимических слоях, включая и аэробную водную толщу, с помощью ПЦР были обнаружены участки гена dsrB, а также выявлено наличие гена 168 рРНК представителей подгрупп Ве$и1/о(отаси1ит, Desulfococcus-Desulfonema-Desulfosarcina и Ве$и1/оу1Ьгчо-Ве$и1/от1сгоЫит. Анализ транслированных аминокислотных последовательностей, кодируемых геном dsrB, показал их наибольшую гомологию с соответствующими последовательностями некультивируемых СРБ из различных морских местообитаний.

Ключевые слова: сульфатредуцирующие бактерии, Балтийское море, Гданьская впадина, хемоклин, вложенная ПЦР, денатурирующий градиентный гель-электрофорез (ДГГЭ), ген dsrB.

DOI: 10.7868/S0026365615020068

Балтийское море представляет собой крупнейший в мире эстуарий нескольких полноводных рек, относящийся к типу мелководных мезотроф-ных морских бассейнов. При средней глубине 51 м водная толща моря, находящаяся в пределах материкового шельфа, характеризуется сложным и неоднородным гидрохимическим составом. С одной стороны, из-за наличия на дне порогов и впадин в придонных слоях возникают застойные явления с появлением сероводорода и других восстановленных соединений. С другой стороны, циркуляции вод мешает стратификация, образующаяся в результате контакта сильно распрес-ненных поверхностных вод речных стоков с более солеными глубинными водами, поступающими с течениями из Северного моря. Эти два слоя разделены переходным слоем скачка солености (га-локлином), который действует как постоянный барьер, препятствующий полноценному обмену опресненных и соленых вод [1]. К галоклину добавляется не менее отчетливый термоклин, формирующийся весной и разрушаемый осенними

1 Автор для корреспонденции (e-mail: npimenov@mail.ru).

штормами, когда вода в проливах перемешивается до самого дна. Содержание кислорода в Балтийском море резко уменьшается к глубинам 80— 90 м и ниже [2]; в частности, в Гданьской впадине, имеющей глубину 107 м, зона хемоклина (переходный слой между верхними фотическими аэробными и нижними анаэробными, содержащими сероводород, водными массами) формируется на глубине 80 м.

Считается, что основная часть сероводорода в подобных морских экосистемах образуется в результате жизнедеятельности сульфатредуцирую-щих бактерий (СРБ), которые, наряду с метано-генными археями, осуществляют терминальные стадии деструкции органического вещества в анаэробных условиях [3]. Несмотря на то, что СРБ традиционно считаются строго анаэробными микроорганизмами, многие из них обладают эффективными ферментативными системами антиокислительной защиты, позволяющими им не только выживать, но и оставаться метаболически активными в местообитаниях, подвергающихся периодическому воздействию кислорода

[4, 5]. Показано, что СРБ в аэробных морских водах могут осуществлять процесс сульфатредукции в различных агрегатах, имеющих внутри микрониши с сильно восстановленными условиями, например, в панцирях морских диатомей [6]. Ранее в процессе исследования Черного моря — крупнейшего меромиктического водоема, нами было показано, что процесс сульфатредукции, а также физиологическиактивные СРБ обнаруживаются не только в глубинных анаэробных водах, но также и в зоне хемоклина и верхней аэробной водной толще [7]. В связи с этим водная толща Балтийского моря в районах впадин также является хорошим объектом для изучения сообществ СРБ, формирующихся при различных концентрациях растворенного в воде кислорода.

Современные мол екулярно - биологические методы, такие как ПЦР и денатурирующий градиентный гель-электрофорез (ДГГЭ) с последующим секвенированием выделенных из отдельных полос участков ДНК, широко используются для изучения природных микробных сообществ. Немногочисленные публикации, касающиеся экологии микроорганизмов Балтийского моря, посвящены СРБ донных осадков и не дают детальной информации о филогенетическом разнообразии этой группы. В работе Синкко и соавт. [8] при исследовании донных осадков открытой зоны Финского залива Балтийского моря методами T-RFLP и клонирования с последующим секвенировани-ем участков гена 168 рРНК было показано присутствие СРБ, принадлежащих к роду БезШ/оЬас-и1а, а также к семейству БезШ/оЬШЬасеае и порядку Вези1/оЬас1ега1е8. В ходе изучения распространения термофильных спорообразующих СРБ в заливе Орхус, расположенном в западной части Балтийского моря, было показано присутствие жизнеспособных эндоспор бактерий рода БезШ/о^тас-и1ит не только в донных осадках, но и в водной толще на глубинах 1 м и 14 м [9].

Поскольку СРБ являются филогенетически неоднородной группой, то для их обнаружения в природных местообитаниях в качестве основного универсального генетического маркера чаще всего используется ген йзгВ [10-12]. Этот ген кодирует Р-субъединицу диссимиляционной (би)сульфит-редуктазы (КФ 1.8.99.1) — ключевого фермента метаболизма всех сульфат- и сульфитредуцирующих микроорганизмов, катализирующего превращение сульфита в сульфид. Помимо упомянутых групп прокариот подобный фермент обнаружен только у фототрофной бактерии АНосктотаНит VI-иозит и облигатно хемолитотрофной бактерии TкioЬacillus йетМ_рсат, в клетках которых он, предположительно, участвует в окислении сульфида [13]. Для более детального изучения состава сообществ СРБ методом ПЦР чаще всего используют праймеры на участки гена 168 рРНК шести основных филогенетических подгрупп СРБ,

предложенных Девере и соавт. по результатам сравнения нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК двадцати двух видов СРБ [14].

Целью настоящей работы было обнаружение и изучение филогенетического состава сообществ СРБ, обитающих в водной толще Гданьской впадины Балтийского моря, с использованием моле-кулярно-биологических методов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе исследовали воду из глубоководной зоны российского сектора Гданьской впадины Балтийского моря в точке с координатами 54.860° N, 19.333° E (станция № 22, рис. 1). Пробы воды отбирали на глубинах 0, 10, 30, 50, 70, 80, 102, 107 и 110 м в 5-л стерильные пластиковые бутыли с борта малого рыболовного траулера МРТК-1073 в июле 2011 г. Для отбора проб использовали батометры зондирующего комплекса типа "Rosette", оснащенного гидрофизическим зондом фирмы "Sea-Bird Electronics, Inc." (США) с датчиками содержания O2, температуры, солености, флуоресценции и Eh. Концентрацию кислорода в водных пробах измеряли также по методу Винклера [15], а сероводорода — колориметрическим методом с использованием ^^диметилпарафенилендиамина [16].

Полученные пробы воды последовательно фильтровали через стекловолоконные крупнопористые фильтры GF/C для задерживания частиц размером >1.2 мкм ("Whatman", Великобритания) и нитроцеллюлозные мембранные фильтры с диаметром пор 0.22 мкм ("Millipore", США) с использованием трубочного перистальтического насоса низкого давления и колбы Бунзена с на-садкой-фильтродержателем. Фильтры хранили в смеси буферный раствор TE (pH 8.0) : этанол (1 : 1) при 4°С. На фильтрах GF/C, задерживающих объекты размером более 1.2 мкм, в основном концентрируются крупные частицы, которые могли содержать в себе клетки СРБ (в дальнейшем мы будем называть их ассоциированными с взвесью), а на мембранные фильтры с диаметром пор 0.22 мкм оседают мелкие частицы, слизь и клетки свобод-ноживущих микроорганизмов (в дальнейшем мы будем называть их свободноживущими клетками). Затем фильтры тщательно растирали пестиком в фарфоровой ступке в жидком азоте до состояния порошка, из которого затем выделяли тотальную ДНК с использованием набора Genomic DNA Purification Kit ("Fermentas", Литва) согласно протоколу производителя.

Для обнаружения СРБ в водных пробах и получения материала для последующего ДГГЭ-ана-лиза использовали олигонуклеотидные праймеры DSRp2060F и DSR4R [10] для ПЦР, специфичные к участку гена dsrB. Для ПЦР-анализа состава со-

19.0° 20.0° 21.0°

Рис. 1. Расположение станции отбора проб воды (№ 22) в глубоководной зоне Гданьского залива Балтийского моря.

обществ СРБ использовали олигонуклеотидные праймеры, специфичные к участкам гена 16S рРНК шести основных филогенетических подгрупп сульфатредукторов [17]. При этом проводили более чувствительную к минорному содержанию 16S рДНК вложенную ПЦР, когда в качестве матрицы использовали не нативную ДНК, выделенную из отфильтрованных водных проб, а продукт амплификации ее участков с праймерами pA и pH', специфичными к гену 16S рРНК Bacteria [18, 19]. Список использованных в исследовании ПЦР-праймеров, синтезированных в компании "Синтол" (Россия), приведен в табл. 1. В качестве контроля при ПЦР использовали в качестве матрицы ДНК Desulfovibrio vulgaris Hildenborough (ATCC 29579) и E. coli TG-1 ("Stratagene", США). Реакционная смесь для ПЦР (25 мкл) содержала ~25 нг тотальной ДНК (или продукта амплификации гена 16S рРНК Bacteria в случае вложенной ПЦР), 2.0 мМ MgCl2, 400 мкМ дНТФ ("Fermentas", Литва), по 500 нМ каждого праймера и 2.5 ед. Taq ДНК-полимеразы ("Синтол", Россия). ПЦР проводили с использованием амплификатора Ge-neAmp PCR

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком