РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2008, том 2(11), № 4 с. 449-453
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
СООТНОШЕНИЕ ОБЩИХ И МЕСТНЫХ РЕАКЦИЙ ИММУНИТЕТА У ДЕТЕЙ ПЕРВОГО ГОДА ЖИЗНИ
© 2008 г. А.П. Топтыгина, Г.В. Бобылева, В.А. Алешкин
ФГУНМНИИэпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского,
Москва, Россия
Поступила: 11.02.08 г. Принята: 25.04.08 г.
Работа посвящена исследованию взаимодействия общего и местного иммунитета детей первого года жизни в процессе микробной колонизации слизистой кишечника. Обследовали 72 ребенка от 1 до 8 месяцев, 18 детей были здоровы (группа 1), 13 детей — с нарушением микробного пейзажа кишечника (группа 2) и 41 ребенок — с лактазной недостаточностью и нарушением микробного пейзажа кишечника (группа 3). Было показано, что количество сывороточных 1дА у детей трех обследованных групп было значимо ниже (р < 0,01), чем у их сверстников тридцать лет тому назад, но не различалось в трех обследованных группах. В то же время, у детей группы 1 количество sIgA в стуле оказалось на порядок меньше, чем в группах 2 и 3 (р < 0,01). Количество цитокинов в сыворотке крови детей трех групп значимо не различалось. При определении цитокинов в копроэкстракте в группе 1 никаких цитокинов обнаружено не было, тогда как в группах 2 и 3 цитокины были обнаружены, хотя и не у всех обследованных детей. Чаще других определялся ИЛ-4. Обращает на себя внимание, что количество цитокинов в копроэкстракте превышало концентрацию соответствующих цитокинов в сыворотке крови в десятки, сотни и даже тысячи раз. Обсуждается роль секреторных 1дА в процессе микробной колонизации кишечника.
Ключевые слова: секреторный 1дА, цитокины, иммунитет слизистых
ВВЕДЕНИЕ
Принятое в классической иммунологии разделение на местный и общий иммунитет достаточно условно, так как в организме все тесно связано. Одним из звеньев, объединяющих местный и общий иммунный ответ, является, несомненно, иммуноглобулин А (1дА). Действительно, сывороточный 1дА — необходимый компонент общего иммунного ответа, а секреторный 1дА (в1дА) — одно из главных действующих лиц местного иммунитета. Синтез 1дА в организме взрослого человека превышает синтез иммуноглобулинов всех других классов вместе взятых и составляет 66 мг/кг в сутки, 80% всех плазматических клеток организма синтезируют 1дА [1, 2]. В то же время, в сыворотке крови 1дА составляет лишь 7—15% от всех сывороточных антител. Большая часть 1дА находится в виде димера в слизистых секретах
Адрес: 125212, Москва, ул. Адм. Макарова 10 E-mail: toptyginaanna@rambler.ru
организма [3]. Хорошо известно, что существуют возрастные особенности синтеза 1дА. От почти полного отсутствия при рождении, уровень 1дА постепенно нарастает, достигая норм взрослого после 10 — 12 лет [4]. Частично недостаток 1дА у грудных младенцев покрывается за счет 1дА материнского молока [5, 6]. Очевидно, синтез иммуноглобулина А индуцируется в организме новорожденных поступающими извне микробными антигенами. В эксперименте было показано, что у взрослых безмикробных животных уровень 1дМ не отличался от такового у конвенциональных мышей. В то же время в слизистой кишечника безмикробных мышей практически отсутствовали плазматические клетки, секретирующие 1дА, тогда как у конвенциональных мышей на одну микроворсинку слизистой кишечника приходилось до 50 продуцентов 1дА. При инокуляции безмикробных животных микроорганизмами нормальной кишечной флоры, количество плазматических клеток, синтезирующих 1дА, в слизистой кишечника увеличивалось в 10-15 раз [7].
Следует также отметить, что благодаря развитию и внедрению в жизнь достижений науки, улучшению качества жизни, изменился спектр заболеваемости детей первых лет жизни. Если 40 — 50 лет назад острые кишечные инфекции занимали одно из лидирующих мест, то сейчас их сильно потеснили дис-бактериозы кишечника, которые и заболеванием-то не считаются. В настоящей работе исследовано, влияют ли особенности микробного пейзажа кишечника детей первого года жизни на уровень продукции сывороточного и секреторного 1дА.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Обследовали 72 ребенка (37 мальчиков и 35 девочек) в возрасте от 1 до 8 месяцев. Восемнадцать детей были здоровы (группа 1), 13 детей с нарушением микробного пейзажа кишечника, именуемым также дисбактерио-зом кишечника (группа 2) и 41 ребенок с лак-тазной недостаточностью и дисбактериозом кишечника (группа 3). Были проведены следующие исследования:
1. Микробиологический посев кала
2. Определение остаточных углеводов в стуле (по Бенедикту)
3. Определение 1дА в сыворотке крови (по Манчини)
4. Определение уровня цитокинов в сыворотке крови
5. Определение sIgA в водно-солевом ко-проэкстракте
6. Определение цитокинов в водно-солевом копроэкстракте.
Получение водно-солевого копроэкстракта
Один объем фекалий смешивали с 3 объемами забуференного фосфатами физраствора (ЗФР), перемешивали, осаждали центрифугированием в течение 15 мин при 3000 об/мин. Надосадок использовали для определения sIgA и цитокинов.
Определение sIgA в копроэкстракте
Исходный копроэкстракт разводили ЗФР до конечной концентрации 1 : 2000. Определение sIgA проводили иммуноферментным методом с использованием коммерческого набора для определения секреторных 1дА (Полигност, Россия) согласно инструкции фирмы-изготовителя.
Определение цитокинов
Содержание в сыворотке и водно-солевом копроэкстракте 7 цитокинов: интерлейкин 1 (ИЛ-1), интерлейкин 2 (ИЛ-2), интерлейкин 4 (ИЛ-4), интерлейкин 5 (ИЛ-5), интерлейкин 6 (ИЛ-6), интерферон гамма (ИФНу) и фактор некроза опухолей альфа (ФНОа), оценивали методом проточной флюорометрии на двулу-чевом лазерном автоматизированном анализаторе (BioPlex Protein Assay System, BioRad, США) с использованием коммерческих тест-систем (определяемый динамический диапазон 0,2-3200 пкг/мл) [8]. Цитокины в сыворотке крови определяли в разведении 1 : 4 в соответствии с инструкцией фирмы производителя, исходный водно-солевой копроэкстракт разводили ЗФР до конечной концентрации
1 : 40.
Статистический анализ
Математическую обработку результатов проводили методами параметрической и непараметрической статистики на компьютере с использованием программы Statistica 5.0. Уровень p < 0,05 считался статистически значимым.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Микроэкология кишечника
При микробиологическом исследовании кала в группе здоровых детей (группа 1) были выявлены соответствующие возрасту количества кишечной палочки, бифидум и лактобак-терий и не обнаружено патогенной или условно патогенной флоры. У детей группы 2 обнаружено снижение нормальной флоры: у 53,8% детей было снижено количество лакто-бактерий, у 23,1% — бифидобактерий и у 15,4% — кишечной палочки. В то же время, у 46,2% детей этой группы выделялась гемоли-зирующая кишечная палочка, у 23,1% — клеб-сиела и у 30,8% — золотистый стафилококк. В третьей группе отмечалось снижение количества кишечной палочки и лактобактерий у 51,2% детей, тогда как бифидобактерии были снижены лишь у 12,2% обследованных детей. Гемолизирующая кишечная палочка высевалась у 36,6% детей, клебсиела — у 39%, золотистый стафилококк — не высевался. Количество остаточных углеводов в стуле в группах 1 и
2 колебалось от 0 до 0,25%, что соответствует возрастной норме. В группе 3 этот показатель
360 300 260 200
мг/мл 1,8
1,61,41,210,80,60,40,2-о-
Лш
/ /
/ , / а- 1= У
до 1 года 2 года старше 3 лет
мг/мл 400
16010050-
о-
У-7
ш
группа 1 группа 2 группа 3
Рис. 1. Сопоставление количества сывороточных 1дА у детей по данным 30-ти летней давности и современных детей
Светлые столбики — по данным на 1975 г. Темные столбики — по данным на 2007 г.
колебался от 1,2 до 2,4%, что и являлось лабораторным подтверждением диагноза лактаз-ной недостаточности.
Определение сывороточных и секреторных IgA
В предварительном обследовании 159 детей, разделенных по возрасту на 3 группы (до одного года, от года до двух и три года и старше) было показано, что современные дети первых двух лет жизни существенно уступают в количестве сывороточных 1дА своим сверстникам тридцатилетней давности, р < < 0,005 (по данным Чернохвостовой с соавторами, 1975), тогда как количество сывороточного 1дА у детей 3 лет и старше точно совпадало с таковым в соответствующей возрастной группе 30-ти летней давности (рис. 1). В наших исследованиях количество сывороточных 1дА у детей трех обследованных групп было значимо ниже (р < 0,01), чем у их сверстников тридцать лет тому назад и составило для группы 1 — 100 ± 47 мкг/мл, для группы 2 — 120 ± 54 мкг/мл и для группы 3 — 137 ± ± 65 мкг/мл. Достоверных различий между детьми трех исследованных групп не обнаружено (рис. 2). В то же время, были обнаружены различия в количестве sIgA в копроэкс-тракте детей трех обследованных групп. Для детей группы 1 количество sIgA в стуле составило 46,4 ± 5,6 мкг/мл; для группы 2 — 202,9 ± ± 16,4 мкг/мл; для группы 3 — 373,9 ± ± 17,3 мкг/мл (см рис. 2). Различия в содержании sIgA в стуле детей группы 1 по сравнению
Рис. 2. Соотношение секреторных и сывороточных 1дА у обследованных детей
Светлые столбики — секреторный 1дА. Темные столбики — сывороточный 1дА
с группами 2 и 3 были статистически значимы (р < 0,01). Различия между группами 2 и 3 статистически не достоверны.
Цитокиновый профиль сыворотки крови и копроэкстрактов
Определение количества цитокинов в сыворотке крови сопряжено с забором крови из вены, учитывая маленький возраст пациентов, этот анализ проводился в том случае, если ребенку были также назначены другие анализы крови. В связи с этим, в группах 1 и 2 определение цитокинов сыворотки крови проводилось у 5 детей, а в группе 3 — у 8 детей. Значимых различий между группами обнаружено не было, и мы сочли возможным объединить по этим показателям всех обследованных детей в одну группу. Полученные результаты приведены в таблице.
Более интересные результаты были получены при определении цитокинов в копро-экстракте. В группе 1 исследуемых цитокинов в копроэкстрактах обнаружено не было, тогда как в группах 2 и 3 цитокины были обнаружены, хотя и не у всех обследованных детей. Результаты о
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.