= БИОХИМИЯ
УДК 577.1:[591.134.5:597.552.512]
СООТНОШЕНИЕ РОСТА И НЕКОТОРЫХ БИОХИМИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ РЫБ НА ПРИМЕРЕ МИКИЖИ Parasalmo mykiss Walb.
© 2010 г. М. В. Чурова*, О. В. Мещерякова*, Н. Н. Немова*, М. И. Шатуновский**
*Институт биологии Карельского научного центра РАН, 185910 Петрозаводск, ул. Пушкинская, 11 **Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН, 119071 Москва, Ленинский просп., 33
E-mail: mchurova@yandex.ru Поступила в редакцию 01.07.2009 г.
С использованием корреляционного анализа установлена достоверная взаимосвязь линейно-весовых характеристик радужной форели (культивируемой формы микижи) с показателем РНК/ДНК и уровнем экспрессии гена цитохром с оксидазы (ЦО) у двухлеток (1+); с уровнем экспрессии гена тяжелой цепи миозина (MyHC) и активностью ферментов ЦО, лактатдегидрогеназы (ЛДГ) мышц и 1-глицерофосфатдегидрогеназы (1-ГФДГ) и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФДГ) печени у двухлеток и трехлеток (1+ и 2+). С возрастом отмечено усиление корреляции между активностью ферментов 1-ГФДГ и Г-6-ФДГ печени радужной форели c массой тела рыб и ослабление корреляции с длиной тела. Обнаружены возрастные и половые различия в экспрессии гена MyHC, активности фермента ЛДГ белых мышц и ферментов печени 1-ГФДГ и Г-6-ФДГ у радужной форели обеих возрастных групп.
В последние годы появилось большое количество исследований, посвященных связям количественных показателей роста рыб (длины и массы тела) с биохимическими показателями. Они выполнены на радужной форели (Overturf, Hardy, 2001; Rowlerson, Vggetti, 2001; Nikki et al., 2004; Johansen, Overturf, 2005, 2006; Trenzado et al., 2006), атлантическом лососе (Hevroy et al., 2006), кижуче (Hill et al., 2000), атлантической треске (Houlihan et al., 1988; Pelletier et al., 1995), мозамбикской тиляпии (Helms et al., 1987; Rodgers, et al., 2003), карпе (Ennion et al., 1995) и других видах.
В большинстве этих исследований использован ограниченный набор показателей, не оценена их связь друг с другом, с полом, возрастом, массой и длиной тела рыб. В связи с этим целью нашего исследования было изучение взаимосвязей линейно-весовых характеристик особей радужной форели разного возраста, пола, массы и длины тела с величиной ряда биохимических показателей, а также оценка корреляции этих показателей между собой. Определялись соотношение РНК/ДНК, уровень экспрессии генов тяжелой цепи миозина и цито-хром с оксидазы, активность цитохром с оксидазы, лактатдегидрогеназы, глюкозо-6-фосфадегидроге-назы и 1-глицерофосфатдегидрогеназы. Эти показатели были выбраны на основании анализа приведенных выше литературных данных, а также результатов собственных исследований (Павлов и др., 2007; Мещерякова и др., 2008), как наиболее информативные, отражающие интенсивность пластического (оцениваемого по показателям роста) и энергетического обмена рыб. Радужная форель
(микижа) является наиболее удобным, модельным объектом для таких исследований, поскольку по этому виду выполнено большое количество физиологических и биохимических работ. Кроме этого, в условиях искусственного выращивания снижается вероятность действия случайных факторов на отдельных особей; относительно большие размеры радужной форели обеспечивают необходимое количество биоматериала, а имеющийся банк генетических данных — возможность изучения уровня экспрессии различных генов.
Определение физиолого-биохимических показателей, скоррелированных с ростом для такого важного объекта рыбоводства как радужная форель имеет большие практические перспективы в совершенствовании биотехники ее товарного выращивания.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Радужная форель — культивируемая форма микижи (РататЫо шуШзз ^МЬ.) в возрасте 1+ и 2+ была отловлена в садках форелевого хозяйства, расположенного в районе Суйсарьской губы Онежского озера (Республика Карелия) в августе 2008 г. при температуре воды 15.9°С. При этой оптимальной температуре в этот период времени происходит интенсивный рост рыб. Особи в возрасте 1+ и 2+ выращивались в отдельных соседних промышленных садках при идентичных условиях.
У каждой особи определяли длину тела по Смиту (с точностью до 1 мм) и массу тела (с точностью до 1 г).
1.0
0.8
К
Я 0.6
5
а я 0.4
Р
0.2
0
(а)
Мелкие Средние Крупные
ш
(б)
f
0 1 □ 2 □ 3
Мелкие Средние Крупные
Рис. 1. Значение показателя РНК/ДНК у самцов и самок радужной форели в возрасте 1+ (а) и 2+ (б), различающихся своими размерами: 1 — вся выборка, 2 — самцы, 3 — самки (для рис. 1—3).
С использованием методов вариационной статистики произведена группировка данных по размерно-весовым показателям самок и самцов радужной форели обоих возрастов. Составлены вариационные ряды и определены их основные характеристики (минимальное и максимальное значение, средняя величина признака).
Тотальную РНК выделяли из белых мышц по Хромчински и Сакхи (Chomczynski, Sacchi, 1987) с помощью набора "для выделения тотальной РНК Yellow Solve" (Клоноген, С.-Петербург). ДНК белых мышц выделяли методом Альанаби и Мартинеса (Aljanabi, Martinez, 1997). Концентрации РНК и ДНК определяли спектрофотометрически (спектрофотометр "SmartSpec Plus", BioRad, США). Уровень экспрессии генов тяжелой цепи миозина (MyHC) и цитохром с оксидазы определяли в белых мышцах методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Тотальную РНК обрабатывали ДНКазой (10 ед/мл) (Силекс, Россия). Комплементарную ДНК (кДНК) синтезировали из препарата тотальной РНК с использованием MMLV-обратной транскриптазы и случайных гексонуклеотидов (набор "Синтез первой цепи ДНК", Силекс). Концентрацию кДНК измеряли спектрофотометрически. Амплификацию проводили на приборе i-Cycler с оптической приставкой IQ5 (BioRad) с использованием реакционной смеси для проведения ПЦР-РВ в присутствии ин-теркалирующего красителя SYBR Green I (Синтол, Россия). Праймеры для генов ß-актина и MyHC подбирали с помощью программы Beacon Designer 5.0. Последовательности праймеров следующие: миозин MyHC (GenBank Z48794) прямой 5'-GCTGAGAAGGACGAGGAGATG-3', обратный 5'-GCCTGCCTGTTGGAGTGG-3'; ß-актин (GenBank AJ438158) прямой 5'-TGGACTTTGAGCAG-GAGATGG-3', обратный 5'-TCGTGGATACCG-CAAGACTC-3'. Последовательность олигонук-леотидов для амплификации гена субъединицы IV цитохром с оксидазы: прямой 5'-TACGTGGGG-GACATGGTGTT-3', 5'-CCCAGGAGCCCTTCTC-
CTTC-3'(Koltitz etal, 2008). Протокол ПЦР: денатурация ДНК при 95°С 5 мин; повторяющиеся циклы (50): денатурация ДНК при 95°С 20 с, отжиг праймеров при 59°С по 30 с, элонгация ДНК при 72°С по 30 с; с последующей процедурой плавления фрагментов ДНК. Концентрацию матричной РНК в виде кДНК определяли по стандартной кривой. Уровень экспрессии исследуемых генов нормализовали по уровню экспрессии референсного гена р-актина. Данные выражались как отношение концентрации мРНК исследуемого гена к концентрации мРНК р-акгина.
Общую активность ферментов лактатдегидроге-назы (ЛДГ, 1.1.1.27) в мышцах, глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы (Г-6-ФДГ, 1.1.1.49) и 1-глицерофос-фатдегидрогеназы (1-ГФДГ, 1.1.1.8) в печени определяли по общепринятым методикам (Кочетов, 1980). Активность цитохром с оксидазы (цитохро-моксидаза, ЦО, КФ 1.9.З.1.) определяли в мышцах по методу Смита (Smith, 1955), при этом цитохром с восстанавливали двукратным по массе количеством аскорбиновой кислоты в 0.02 М фосфатном буферном растворе (рН 7.0) в течение 2 ч и затем на колонке с сефадексом G-25 выделяли в восстановленной форме свободным от избытка восстановителя. Различия в активности ферментов и других показателей оценивали по критерию t-Стьюдента. Различия считали достоверными прир < 0.05. Коэффициенты корреляции между сравниваемыми показателями определяли по Пирсону (Юнкеров, Григорьев, 2002).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В каждом из двух исследованных возрастных классов (1+, 2+) условно выделены 3 фенотипиче-ские группы: мелкие, средние и крупные особи (табл. 1, 2). Данные по ряду биохимических характеристик этих групп приведены на рис. 1—3.
Таблица 1. Линейно-весовые характеристики самцов и самок радужной форели в возрасте 1 +
Группа особей по размеру
Показатель
Вся выборка
Самцы
Самки
Мелкие
Средние
Крупные
Вся выборка
Количество Длина Ьзш, см
Масса Q, г
Количество Длина Ьзш, см
Масса Q, г
Количество Длина Ьзш, см
Масса Q, г
Количество Длина Ьзш, см
Масса Q, г
особей M±m min—max
M ± m min—max особей M ± m min—max
M ± m min—max особей M ± m min—max
M ± m min—max особей M ± m min—max
M ± m min—max
28
22.36 ± 0.37 18.0-24.8 162.19 ± 8.76 75.9-253.1 55
27.29 ± 0.23 24.9-31.7 308.80 ± 11.66 168.0-600.4 17
34.86 ± 0.47
31.8-38.6 602.95 ± 29.78
432.9-966.0 100 27.19 ± 0.45 18.0-38.6 317.76 ± 16.72
79.9-966.0
13
22.33 ± 0.55
19.2-24.8 172.28 ± 14.76
91.3-252.1 26
27.21 ± 0.37 24.9-31.7 317.30 ± 16.49 168.0-497.4 7
35.67 ± 0.60 32.3-37.0 637.84 ± 23.45 564.3-755.0 46
27.11 ± 0.68
19.2-37.0 325.09 ± 24.30
91.3-755.0
15
22.39 ± 0.51 18.9-24.8 153.44 ± 10.14 75.9-253.1 29
27.36 ± 0.31 24.9-31.3 301.20 ± 16.62 172.0-600.4 10
34.30 ± 0.64
31.8-38.6
578.50 ± 47.57 432.9-966.0
54
27.26 ± 0.60 18.0-38.6
311.51 ± 23.20
75.9-966.0
КОРРЕЛЯЦИЯ ЛИНЕЙНО-ВЕСОВЫХ ПАРАМЕТРОВ САМЦОВ И САМОК ФОРЕЛИ В ВОЗРАСТЕ 1+ И 2+ С УРОВНЕМ ИССЛЕДОВАННЫХ БИОХИМИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ
Показатель РНК/ДНК. Количественное определение нуклеиновых кислот в скелетных мышцах и отношение РНК/ДНК используется как показатель скорости роста на ранних стадиях развития пресноводных и морских рыб в зависимости от влияния различных условий (питание, стресс, загрязнение водоема и др.) и возраста. Он показывает, как меня-
ется уровень клеточной РНК и, соответственно, синтез белка при постоянной концентрации ДНК в клетке (Grant, 1996; Vinagre et al., 2008). Согласно ряду исследований (Mathers et al., 1992; Houlihan etal., 1993; Peragon et al., 2001) относительная скорость роста рыб и темп прироста мышечной массы сопровождается увеличением количества копий РНК на единицу ДНК, т.е. положительно коррелирует со значением показателя РНК/ДНК.
Результаты нашего исследования показали (рис. 1, табл. 3), что у радужной
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.