БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1998, том 24, № 4, с. 293-299
ЩК 577.152.342*153.02
СОПРЯЖЕНИЕ ГИДРОЛИЗА ATP И ИРОТЕОЛИЗА ПРИ ФУНКЦИОНИРОВАНИИ IN VITRO МУТАНТНЫХ ПО АТР-АЗНОМУ ЦЕНТРУ ФОРМ Lon-ПРОТЕИНАЗЫ Е. coli
© 1998 г. Э. Э. Мельников, К. Б. Цирульников, Л. М. Гинодман, Т. В. Ротанова*
Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и ЮЛ. Овчинникова РАН, 117871, Москва, ГСП-7, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Поступила в редакцию 19.09.97 г. Принята к печати 27.10.97 г.
С целью идентификации аминокислотных остатков АТР-азного домена 1 -оп-протеиназы Е. coli, участвующих в гидролизе АТР и входящих в систему передачи сигнала с АТР-азного домена на проте-олитический, проведена модификация потенциально важных остатков АТР-азного домена методом направленного мутагенеза и исследованы свойства полученных мутантных форм фермента. Установлено, что остатки К362, Т363 (мотив А Уолкера) и ÍJ423 (мотив [i) участвуют в катализе гидролиза A I P. При этом К362 и Т363 участвуют также в системе междоменного сопряжения, a D423, по-видимому, не играет существенной роли в функционировании этой системы. Остаток D387 важен для функционирования АТР-азного центра, однако не является каталитически активным, как постулировано в литературе. Показано также, что определенную роль в системе междоменной передачи сигнала сопряжения играет остаток Y493,
Ключевые слова: А TP-зависимый протеолиз; Lon-протеиназа; активный центр; А ТР-аза; ген Ion; мутагенез; Е. coli.
АТР-зависимый протеолиз относится к числу ииверсальных внутриклеточных процессов [1]. Энергозависимые протеиназы играют ключевую роль в регуляции клеточных функций у прокариот и эукариот. Наиболее подробно АТР-зависи-:ый протеолиз изучен в клетках Escherichia coli. У этого микроорганизма главная роль в АТР-за-внеимом расщеплении белков принадлежит Lon-лротеиназе, относящейся к группе белков теплового шока [2-5].
В клетках Е. coli Ьоп-протеиназа (КФ 5.4.21.53) осуществляет быстрое селективное расщепление дефектных и ряда короткоживущих регуляторных белков [6]. Известны некоторые
эндогенных субстратов Lon-протеиназы: SuiA, RcsA, CcdA [7-10]. К настоящему времени обнаружено около 10 представителей Lon-протеиназ из эволюционно удаленных источников [11].
Ьоп-протеиназа Е. со//-гомотетрамерный белок с молекулярной массой субъединицы 87400 [12]. Субъединица Ьоп-протеиназы имеет доменную: организацию (рис. 1) и включает:
N-копцевой домен, функция которого в настоящее время не определена;
" Автор для переписки (тел.: (095) 335 42-22. e-mail: ßotanova@enzyme.siobc.ras.ru).
центральный АТР-азный домен, содержащий так называемые мотивы Уолкера А и В [13] -консервативные фрагменты первичной последовательности с аминокислотными остатками, участвующими в образовании каталитической области АТР-азного центра, а также в связывании и продуктивной для гидролиза координации трифо-сфата нуклеотида и иона Mg2+;
С-копцевой протеолитический домен с каталитически активным остатком S679 [14].
Фермент является уникальной сериновой про-теиназой, активность которой сопряжена с гидролизом АТР [15- -19]. Гидролиз белковых субстратов осуществляется только в присутствии АТР, как полагают, по процессивному механизму (без высвобождения промежуточных продуктов и с образованием конечных пептидов определенного размера). Ьоп-протеиназа гидролизует также некоторые низкомолекулярные пептидные субстраты. причем пептидазная активность может реализоваться в присутствии некоторых негидроли-зуемых аналогов АТР [20].
АТР-азная активность Ьоп-протеиназы наблюдается и в отсутствие белкового субстрата "базовая" АТР-азная активность), но возрастает в несколько раз в его присутствии. При этом активация гидролиза АТР осуществляется интакт-ным белком-субстратом, а не продуктами его гидролиза, о чем свидетельствует увеличение АТР-
-,387 v493
Se7*
1 102
560
ND AD HD
G PPG V GK ?62T3fi 3 L FLLD42
ä|
Мотив А
Мотив В
Рис, 1. Схема строения Ьоп-протеиназы Е. соП. Указаны предполагаемые границы доменов (N0. АО. РО: Гч'-концевой, АТР-азный и протеолитический соот-ветстпенно), каталитический остаток протеолитичес-кого центра 8679 и аминокислотные остатки АТР-аз-ного домена, исследованные в настоящей работе (обозначены номерами).
Рис. 2. Схема функционирования Ьоп-протеипазы Е. coli (по работе [ 1)).
азнои активности в присутствии белкового субстрата у протеолитически неактивного мутанта Ьоп-протеиназы (Ьоп-5679А) [21].
Современные представления о функционировании Ьоп-протеиназы при гидролизе белковых субстратов изложены в работах [1, 22]. В основу модели положены следующие принципы:
а) А'ГР и АЬР связываются по АТР-азному центру фермента и аллостерически влияют на конформацию протеолитнческого центра;
б) белковый субстрат связывается в двух центрах - аллостерическом и протеолитическом, при этом связывание белкового субстрата в аллостерическом центре влияет как на конформацию протеолитнческого центра, так и на связывание нуклеотидов в АТР-азном центре ("хороший" белковый субстрат вызывает обмен прочно связанного А1)Р на АТР);
в) субъединицы Ьоп-протеиназы функционируют кооперативно, и расщепление пептидных связей белкового субстрата происходит поочередно в активных центрах взаимодействующих субъединиц.
Простейшая схема, описывающая каталитический цикл Ьоп-протеиназы, представлена на рис. 2. Как полагают, при функционировании фермента
АТР выступает в качестве модифицируемого ал-лостерического эффектора: связывание и гидролиз АТР влияют на взаимодействие белка с алло-стерическим и/или протеолитическим центрами на ферменте [22].
Основными принципиально важными проблемами при изучении АТР-зависимого нротеолиза остаются: выявление природы селективности действия АТР-зависимых протеиназ, реализуемой в результате гидролиза АТР, и исследование сопряжения гидролиза АТР и протеолиза.
¿Можно полагать, что сопряжение протеолиза с гидролизом АТР в значительной степени определяется междоменными взаимодействиями в ферменте. При исследовании такого рода взаимодействий перспективно изучение модифицированной Ьоп-протеиназы, утратившей сопряжение между АТР-азным и протеолитическим доменами (функциональное разобщение доменов при сохранении целостности полипептидной цепи). Такие формы Ьоп-протеиназы можно получить направленным мутагенезом остатков, вовлеченных в систему передачи сигнала между центрами. Компонентами этой системы следует считать также и активные центры фермента - А'ГР-азный и протеолитический (донор и акцептор сигнала соответственно).
В связи с этим в настоящей работе решалась задача идентификации аминокислотных остатков АТР-азного домена Ьоп-протеиназы, участвующих в гидролизе А ГР и, возможно, Б передаче сигнала с АТР-азного центра на протеолитический (т.е. входящих в систему междоменного со-пряжения), с помощью модификации потенциально важных аминокислотных остатков методом направленного мутагенеза и изучения свойств полученных мутантных форм Ьоп-протеиназы.
При идентификации функционально важных остатков АТР-азного домена мы учитывали предложенную в литературе гипотезу о том, что различные белки, содержащие мотивы Уолкера А и В (в том числе и Ьоп-протеиназы), обладают сходной топологией нуклеотид-триггерных доменов даже в отсутствие высокой гомологии первичных структур [23]. Используя данные рентге-ноструктуриого анализа, полученные для некоторых нуклеотид-триггерных белков, авторы гипотезы предложили обобщенную модель строения нуклеотид-триггерных доменов и схему взаимодействия остатков мотивов Уолкера с фосфатной частью нуклеотида в активных центрах ферментов. Авторы полагают, что наряду с аминокислотными остатками, принадлежащими мотивам Уолкера [13, 24], ключевую роль в катализе гидролиза нуклеотидов играет определенный остаток дикарбоновой аминокислоты, локализованный между мотивами А и В (для Ьоп-протеи-
Ьелковый субстрат
ЛОР
ЛТР-М»
Пептидные продукты
Гидролиз субстратов
•• .вы. по мнению авторов, это 0387). Кроме того, -: той же работе [23] постулируется существование в структурах А'ГР-аз и GTP-аз, сопрягающих гидролиз пуклеотида с другой функцией, аминокислотных остатков тирозина или глутамина, имеющих ключевое значение в передаче конфор-кщионных изменений, т.е. сигнала, с нуклеотид-триггерного центра к функциональному домену •з случае Ьоп-протеиназы -■ протеолитическому). Такой остаток должен был бы располагаться на расстоянии приблизительно 50 а.о. от мотива В в сторону С-концевой области молекулы. В указанной области Ьои-протеиназа не содержит ни глутамина, ни тирозина. Ближайшие консервативные остатки тирозина это Y456 и Y493, а глутамина - Q448. Можно было полагать, что один из этих остатков входит и систему передачи сигнала.
Для исследования функциональной роли остатков «362 и Л'363 из мотива A, D423 из мотива потенциального каталитического остатка D387 и одного из возможных переносчиков сигнала, Y493, были получены мутантные формы Ьоп-протеиназы с заменами по указанным остаткам (табл. ]).
Материалом для проведения мутагенеза послужила векторная конструкция pBR-lon, полученная ¡janee » результате клонирования гена Ion _ собственной peí уляторной областью в плазмиде pBR327 [12]. Введение мутации, приводящих к заменам Т363А, D423N, D387N, Y493F в аминокислотной последовательности Ьоп-протеиназы, бы-:о осуществлено при использовании четырех-праймерного метода мутагенеза, основанного па ПЦР. Мутация, приводящая к замене K3Ó2Q. была введена ранее методом, описанным в работе ! 14]. Аминокислотные замены произведены с учетом частоты встречаемости естественных мутаций в белках [25] Структура олигопуклеотидных прай-меров, использованных в мутагенезе, приведена в "Экспериментальной части". Введение мутаций подтверждено секвенированием.
Выделение мутантных форм фермента проводили по методике, разработанной для нативного белка [26]. Чистота препаратов ферментов i;o всех случаях была близка к 90%, по данным гель-электрофореза. Эксперименты по определению активности воспроизводили не менее трех раз, используя препараты ферментов из различных выделении.
Результаты определения АТР-азной (в присутс
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.