»
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2ООО, том 26, № 7, с. 530-538
УДК 577.152.342*153.02
СОПРЯЖЕНИЕ ПРОТЕОЛИЗА И ГИДРОЛИЗА АТР ПРИ ФУНКЦИОНИРОВАНИИ Lon-ПРОТЕИНАЗЫ Escherichia coli. I. КИНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ГИДРОЛИЗА АТР
© 2000 г. Э. Э. Мельников, К. Б. Цирульников, Т. В. Ротанова*
Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117871, Москва, ГСП-7, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Поступила в редакцию 24.01.2000 г. Принята к печати 02.03.2000 г.
Исследован ряд аспектов проявления АТР-азной функции Ьоп-протеиназы Escherichia coli вблизи оптимального значения pH. Выявлено, что в отсутствие белкового субстрата максимальная АТР-азная активность фермента наблюдается при эквимольном соотношении АТР и ионов Mg2+ в области их миллимолярных концентраций. Свободные компоненты субстратного комплекса (ATP-Mg)2 ингибируют АТР-азную активность фермента. Высказано предположение, что эффекторное действие свободных ионов Mg2+ вызывается образованием "ADP-Mg-формы" АТР-азных центров. Показано, что активация гидролиза АТР в присутствии белкового субстрата сопровождается увеличением сродства комплекса (ATP-Mg)2- к ферменту, устранением ингибирующего действия свободных ионов Mg2+ без изменения эффективности катализа гидролиза АТР (по значению к^), а также изменением типа ингибирования гидролиза АТР комплексом (ADP-Mg)~ (без изменения значения Ki). Прямым экспериментом продемонстрировано взаимодействие белкового субстрата Ьоп-протеиназы с областью фермента, локализованной вне пептидгидролазного центра.
Ключевые слова: АТР-зависимый протеолиз; Ьоп-протеиназа; АТР-аза; ген Ion; Е. coli.
ВВЕДЕНИЕ
Биологическое значение внутриклеточных про-теиназ определяется двумя функциями этих ферментов: регуляторной и деструктивной.В первом случае протеиназы осуществляют процессинг белков и контролируют содержание в клетке ре-гуляторных белков. Во втором случае протеолиз позволяет устранять нефункциональные "балластные" белки, синтезирующиеся, например, при ошибочной экспрессии генов или в результате временного пребывания организма в состоянии стресса, а также чужеродные белки, образующиеся в инфицированных клетках. Деструктивный протеолиз носит защитный характер и обеспечивает организм аминокислотным и пептидным материалом.
Установлено, что ключевую роль и у прокариот, и у эукариот при внутриклеточном протеолизе играют энергозависимые ферменты, протеолити-ческая активность которых сопряжена с гидролизом АТР. Эти протеиназы отличаются сложной структурной организацией и выполняют, по-видимому, комплексную функцию - и деструктивную и регуляторную. Наиболее подробно АТР-зави-симый протеолиз изучен в клетках Escherichia coli [1-3]. У этого микроорганизма главная роль в
"Автор для переписки (тел.: (095) 335-42-22; e-mail: Rotanova@enzyme.siobc.ras.ru).
АТР-зависимом расщеплении белков принадлежит Lon-протеиназе (КФ 3.4.21.53), относящейся к группе белков теплового шока [4-7].
В клетках Е. coli Ьоп-протеиназа осуществляет быструю селективную деградацию дефектных и некоторых короткоживущих регулятореых белков. Известен ряд эндогенных субстратов Ьоп-протеиназы: SulA, RcsA, CcdA [8-1 J] и др. К настоящему времени обнаружено около 20 представителей Ьоп-протеиназ из эволюционно удаленных источников [12].
Ьоп-протеиназа Е. coli (далее Ьоп-протеиназа, Ьоп) - гомотетрамерный белок с молекулярной массой субъединицы 87400 [13, 14]. Субъединица фермента имеет доменную организацию и включает: /V-концевой домен (N), функция которого в настоящее время не определена; центральный АТР-азный домен (А); С-концевой протеолитиче-ский домен (Р) с каталитически активным остатком Ser679 [15].
Фермент является уникальной по строению протеолитического центра сериновой протеина-зой, активность которой сопряжена с гидролизом АТР [12, 16-20]. Гидролиз белковых субстратов ферментом осуществляется по процессивному механизму с образованием пептидов определенного размера без высвобождения промежуточных продуктов [17].
Несмотря на относительные успехи в изучении АТР-зависимых иротеиназ методами биохимической генетики на клеточном уровне, основные молекулярно-энзимологические проблемы, общие для этих ферментов, во многом не решены и представляют собой актуальную научную задачу. Наиболее важное значение имеют вопросы, связанные с выяснением принципов узнавания этими ферментами своих субстратов (проблема селективности) и принципов сопряжения гидролиза АТР и протеолиза (проблема сопряжения).
Имеющиеся данные [1-3, 21] позволяют рассматривать АТР-азную функцию Ьоп-протеина-31д как регуляторную. Однако исследования, устанавливающие закономерности этой регуляции [18, 22] единичны и недостаточны. Согласно одному из представлений, развиваемому в связи с проблемой селективности и утвердившемуся в настоящее время [23, 24], посредством гидролиза АТР регулируется протеолитическая активность фермента. При этом ключевым фактором такой регуляции является белковый субстрат, в отсутствие которого фермент находится в протеолити-чески неактивной "ADP-формс". Связывание с Ьоп-протеиназой белка-субстрата не только обусловливает переход фермента в протеолитически активную "АТР-форму", но и активирует гидролиз АТР. Таким образом деградации Ьрп-протеи-назой будут подвергаться только те белки, которые способны активировать гидролиз АТР.
В настоящей работе с учетом принципиальной важности АТР-азяой функции Ьоп-протеиназы исследованы причины понижения АТР-азной активности фермента в отсутствие белка-субстрата, характер активации гидролиза АТР при протео-лизе, а также возможное ингибиругощее действие продукта гидролиза А'ГР - аденозиндифосфата.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В проведенных экспериментах для регистрации АТР-азной активности Ьоп-протеиназы был использован метод спектрофотометрического определения неорганического фосфата по образованию цинк-фосфомолибдатного комплекса [25].
В стандартных условиях (50 мМ Трис НС1- буфер. рН 7.8, 100мМ NaCl,5% глицерин-буфер А, 37°С) фермент проявляет свойства медленной АТР-азы с удельной активностью 20-30 моль Р, мин-1 моль-1 белка (базовая активность). При насыщающей концентрации белка-субстрата в этих условиях АТР-азная активность фермента увеличивается примерно в 2.5 раза (удельная активность-50-70 моль Р, мин-1 моль : белка). При этом активация гидролиза АТР осуществляется интактным белком-субстратом, а не продуктами его гидролиза, и не связана с функционированием пептидгидролазных центров фермента: эффект
v0', мин мМ 1
Рис, 1. Зависимость начальной скорости гидролиза АТР Ьоп-протеиназой от общей концентрации ионов Mg2+ в отсутствие белкового субстрата. Условия: буфер А, рН 7.8; 37°С. Концентрации: Lon - 0.64 мкМ; АТР - 0.4 (У) или 2.5 мМ (2).
наблюдается при взаимодействии белка-субстра-та с протеолитически неактивной формой Ьоп-протеиназы с мутацией по каталитически активному остатку Ser679 в протеолитическом центре (Lon-S679A) [15, 26]. В то же время гидролиз ферментом низкомолекулярных пептидных субстратов не сопровождается изменением АТР-азной активности [16].
Вероятной причиной ускорения гидролиза АТР при связывании белка-субстрата с ферментом может быть увеличение эффективности нук-леотидного обмена и/или активация каталитического аппарата его АТР-азных центров.
Зависимость АТР-азной активности от содержания нонов М«2+. Ионы Mg2+ играют роль необходимого активатора гидролиза АТР Ьоп-протеиназой (в отсутсгвие этих ионов АТР не гидролизу-ется). Максимальная АТР-азная активность (рис. 1) наблюдается при соотношении САТР : СМ;, 1 : 1
^d(ATPM»r" ~ ^ ** Наличие свободных ионов
Mg2+ (См& > САТР) или свободного АТР (См„ < САТР) приводит к ингибированию гидролиза АТР в отсутствие белка-субстрата.
Ингибирование как свободным нуклеотидом, так и ионами Mg2+ может быть объяснено тривиальной конкуренцией между субстратом (комплексом (ATP-Mg)2~) и свободными компонентами при связывании в АТР-азном центре фермента (схема 1а).
С другой стороны, эффект ингибирования гидролиза АТР свободными ионами Mg2+ должен проявляться, если предположить возможность связывания этих ионов с промежуточной "ADP-формой" фермента ЕР (схема 16). В этом случае высвобождение ADP из АТР-азного центра фермента - стадия, которой предшествует высвобождение ионов
ES
(а)
Рр Mg2+ EPp¡Mg —^ ЕР-- Е + Р
El
ES
p¡; Mg2+
EPp¡Mg —^ ЕР-- E + P
" Mg2+ EPMg
Схема 1. Ингибирование в отсутствие белка-активато-ра гидролиза АТР Lon-протеиназой при конкурентном (а) и бесконкурентном (б) связывании с ферментом компонентов комплекса (ATP-Mg)2-. Обозначения: Е-фермент; S - субстрат (ATP-Mg)2-; I - ингибитор (АТР или Mg2+); Р - продукт (ADP); р; - неорганический фосфат.
Mg2+, и торможение гидролиза АТР происходит за счет ухудшения эффективности нуклеотидного обмена вследствие бесконкурентного ингибирую-щего действия свободных ионов Mg2+.
Зависимости, характеризующие АТР-азную активность фермента при различном содержании ионов Mg2+, представлены на рис. 2. В отсутствие свободных ионов Mg2+ (рис. 2, 1) гидролиз АТР Ьоп-протеиназой характеризуется параметрами: ксм 100 мин-1, Кт 0.54 мМ. При введении избытка
, мин мМ
240 -
200 -
160 -
120 -
80
40 -
0 i - "'í'
-4 -3 -2 -1
0 12 3 [(ATP-Mg)2-]"1, мМ-1
Гис. 2. Гидролиз АТР Ьоп-протеиназой в отсутствие белкового субстрата при фиксированных значениях концентрации свободных ионов Mg2+. Условия: буфер А, рН 8.2; 37°С. Концентрации: Lon - 0.32 мкМ; Mg24" - 0 (/), Ю (2), 20 (3), 30 мМ (4). Зависимость для
переходной концентрации Mg чена штриховой линией.
2+
(10-15 мМ) обозна-
свободных ионов Mg2+ в концентрациях, не превышающих значений 10-15 мМ, значения kcal и Кт уменьшаются пропорционально (бесконкурентное ингибирование, прямые 7 и 2). Дальнейшее увеличение содержания магния в реакции приводит к изменению характера ингибирования (прямые 3 и 4): значения Кт увеличиваются при постоянстве кш (конкурентное ингибирование). Построение гипотетической зависимости (обозначена на рис. 2 штриховой линией), соответствующей критической концентрации свободных ионов Mg2+ (около 15 мМ), при которой осуществляется переход от бесконкурентного ин
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.