БИОХИМИЯ, 2006, том 71, вып. 11, с. 1561 - 1569
УДК 581.198
СОСТАВ И КАТАЛАЗОПОДОБНАЯ АКТИВНОСТЬ МАРГАНЕЦ(П)-БИКАРБОНАТНЫХ КОМПЛЕКСОВ*
© 2006 г. К.Г. Тихонов, О.М. Застрижная, Ю.Н. Козлов, В.В. Климов**
Институт фундаментальных проблем биологии РАН, 142290 г. Пущино Московской обл., ул. Институтская, 2; факс: (4967)330-532, электронная почта: klimov@issp.serpukhov.su
Поступила в редакцию 18.05.06 После доработки 16.06.06
Изучены состав и каталазоподобная активность комплексов Мп2+ с бикарбонатом вольтамперометричес-ким и кинетическим (по скорости образования О2 из Н2О2) методами. На графике зависимости потенциала восстановления Мп2+ от логарифма концентрации (1кС№НСОз) бикарбоната показаны три линейных участка с наклонами 0 мВ/^СМаНСОз, —14 мВ/^С№НСОз и —59 мВ/^СМаНСОз, которые относятся соответственно к водному комплексу Мп^+ и Мп2+-бикарбонатным комплексам состава [Мп2+(НСО-)]+ (при концентрации НСО3- 10-100 мМ) и [Мп2+(НСО-)2]0 (при концентрации НСО3- 100 -600 мМ). Сопоставление концентрации НСО-, необходимой для проявления каталазоподобной активности у Мп2+, с электрохимическими данными показало, что только электронейтральный комплекс Мп2+(НСО-)2 катализирует разложение Н2О2, тогда как положительно заряженные водный комплекс Мп^+и комплекс [Мп2+(НСО-)]+ не активны. При замене НСО- на анионы карбоновых кислот (ацетат и формиат) каталазоподобная активность Мп2+ не проявляется. Скорость выделения О2 в системе Мп2+-НСО3--Н2О2 (рН 7,4) пропорциональна концентрации Мп2+ во второй степени и концентрации НСО3- в четвертой степени, что указывает на одновременное участие двух комплексов Мп2+(НСО-)2 в реакции разложения Н2О2.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: марганец, бикарбонат, перекись водорода, каталазная активность.
Известно, что ионы бикарбоната (НСО3) необходимы для проявления наибольшей активности фотосистемы II (ФС II) [1]. Стимулирующее воздействие НСО- на ФС II было подробно описано для процессов, происходящих на акцепторной стороне ФС II, где НСО- связывается с негемовым Fe, расположенным между QA и QB, и ускоряет перенос электрона между QX и QB, а также, вероятно, служит донором протона для восстановленного QB [2-4].
Бикарбонат необходим для стабилизации и функционирования водоокисляющего комплекса (ВОК) ФС II [1]. После удаления всех четырех ионов марганца, входящих в состав ВОК, из субхлоропластных препаратов ФС II, эффективное фотоокисление экзогенных катионов Mn2+ [5-10] и реактивация выделения кислоро-
Принятые сокращения: ФС II - фотосистема II; ВОК - водоокисляющий комплекс; апо-ВОК - водоокис-ляющий комплекс, не содержащий Mn-кластера; QA и QB -соответственно первичный и вторичный хиноновые акцепторы электронов в фотосистеме II; Mn^+ - водный комплекс Mn2+.
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 06-137, 13.08.2006.
** Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
да [10-12] наблюдались, если стехиометричес-кие количества Мп2+ (2-4 атома Мп2+ на реакционный центр ФС II) добавлялись вместе с бикарбонатом. В то же время анионы карбоновых кислот (ацетат, формиат) не обладали подобным действием. Было предположено, что стимулирующее действие бикарбоната на реактивацию переноса электронов на донорной стороне ФС II связано с образованием легкоокисляемых электронейтральных Мп-бикарбонатных комплексов [13], а также с тем, что ионы бикарбоната вместе с Мп2+ могут связываться с ФС II, не содержащей Мп-кластера ВОК (апо-ВОК ФС II), и формировать тройной комплекс [Мп-НСО--апо-ВОК], способный окислять другие ионы Мп2+ во время реконструкции Мп4Ох-центра ВОК [12, 14]. Предположение о том, что бикарбонат может быть субстратом окисления вместо воды в ФС II, было опровергнуто в работах [15, 16]. Однако при этом не исключалась возможность участия бикарбоната в качестве кофактора ВОК.
Сравнивая светоиндуцированные ИК-спект-ры с преобразованием Фурье донорной стороны кислородвыделяющих препаратов ФС II в присутствии МаН12СО3 или МаН13СО3 со спектром,
1561
1562
ТИХОНОВ и др.
приписываемым переходу 81/82, было предположено, что бикарбонат действует в качестве мостикового лиганда между редокс-активным Мп и Са2+ внутри ВОК [17]. Данные по дифракции рентгеновских лучей с разрешением 3,5 А комплекса ФС II, выделенного из цианобакте-рии, также свидетельствуют в пользу того, что НСО- может быть мостиковым лигандом между Са2+ и атомом Мп, обозначенным в [18] как Мп4, хотя в последней публикации по рентгено-структурному анализу ФС II ион НСО- не был обнаружен в ВОК [19].
Предположение о том, что НСО- связывается с Мп2+ в ВОК, усилило интерес к вопросам комплексообразования Мп2+ и Мп3+ с бикарбонатом в модельных системах. В наших работах [13, 20] потенциалы окисления Мп2+ до Мп3+ в водных растворах бикарбоната, формиата, ацетата и оксалата были представлены как функция концентрации лиганда и сопоставлены со способностью этих лигандов стимулировать фотоокисление Мп2+ безмарганцевыми препаратами ФС II. Несмотря на то что все анионы карбоно-вых кислот значительно снижают потенциал окисления Мп2+, только бикарбонат ускоряет перенос электронов от Мп2+ к апо-ВОК ФС II [13].
Известно также, что в присутствии НСО-ионы Мп2+ катализируют диспропорционирова-ние перекиси водорода: 2Н2О2 ^ 2Н2О + О2 [21—26]. Эта каталазоподобная активность, вероятно, связана с образованием Мп2+-бикарбо-натных комплексов [22—26] предположительно состава Мп2+(НСО-)2 [22] или [Мп2+(НСО-)3]-[24]. Известно, что аквакатионы Мп2+ в нейтральных средах практически не катализируют окислительно-восстановительный распад Н2О2 [23]. Присуща ли каталазоподобная активность катионам Мп в составе ВОК, пока не ясно [27, 28].
Цель настоящей работы — определение состава и констант устойчивости Мп2+-бикарбо-натных комплексов методом вольтамперомет-рии, а также выяснение возможной корреляции между составом комплексов, их каталазоподоб-ной активностью и способностью Мп2+ быть донором электронов к реакционным центрам ФС II.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Электрохимическое исследование комплексов Мп2+ проводилось вольтамперометричес-ким методом, как описано ранее [29]. Определялась зависимость потенциала пика (Ер) восстановления Мп2+ до Мп0 на стационарном ртутном катоде от логарифма концентрации
HCO-. Вольтамперные кривые регистрировались полярографом PA 3 (LP, Чехословакия) с использованием трехэлектродной ячейки. Рабочим электродом служила висящая ртутная капля диаметром 0,72 мм, которая обновлялась перед каждым измерением. Вспомогательным электродом служила платиновая пластина площадью 1 см2. Потенциал измеряли относительно насыщенного каломельного электрода, а затем пересчитывали по отношению к нормальному водородному электроду. Точность измерений потенциалов составляла 2 мВ. В качестве фона использовали раствор 0,1 М NaClO4. Для устранения поверхностных эффектов в среду добавляли 0,005% агара. Перед каждым измерением из среды удаляли кислород продуванием аргоном. Измерения проводились при комнатной температуре. Скорость сканирования составляла 20 мВ/с.
Каталазоподобная активность определялась по скорости выделения кислорода, образующегося при разложении перекиси водорода: 2Н2О2 ^ 2Н2О + О2. Концентрация кислорода в водном растворе измерялась амперометричес-ким методом с использованием кислородного электрода типа Кларка («Hansatech», Англия) с объемом ячейки 1 мл при 25°.
Скорость выделения О2 определялась по наклону кинетической кривой концентрации О2 в водном растворе, наблюдавшемуся в течение 1—3 мин после добавления Н2О2 (или MnCl2). Порядок реакции по каждому компоненту определялся с помощью зависимости логарифма скорости выделения О2 из Н2О2 от логарифма концентрации участника реакции. По тангенсу угла наклона этой зависимости определяли порядок реакции по данному компоненту реакции, предположительно соответствующий числу молекул вещества, участвующих в реакции разложения Н2О2.
Добавление NaHCO3 приводит к смещению рН раствора в щелочную сторону из-за реакции гидролиза NaHCO3. Поэтому после растворения NaHCO3 растворы оттитровывали соляной кислотой до заданного значения рН в области 7—8,3. рН определяет отношение равновесных концентраций HCO-/H2CO3 по формуле
pH = 6,35 + lg([HCO3-]/[H2CO3]). (1)
Для поддержания рН использовали Tris-HCl-буфер.
В работе использованы NaHCO3 фирмы «Merck» (США), Tris фирмы «GibcoBRL» (США), Н2О2 (3%-ный раствор), произведенный Ярославской фармфабрикой (Россия).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Электрохимические измерения. Известно, что в водном растворе Мп2+ существует исключительно в виде гексааквакатиона [Мп2+(Н20)6]2+ [30]. В присутствии других лигандов происходит образование более устойчивых комплексов. Этот процесс сопровождается смещением потенциала восстановления Мп2+ до Мп0 в отрицательную сторону, так как при восстановлении катион Мп2+ освобождается от лигандов, что требует дополнительной энергии.
Для расчетов использовали уравнение Лин-гейна [31, 32]
КГ л 0 ят, „
1п/? + д —1п С,, 2
пР пР
в котором Еу1мет и Е
восстановления
Мп2+
Уком - потенциалы полуволн и его комплекса с лиган-
ад
дом X соответственно; в — полная константа устойчивости комплекса; Сх — концентрация ли-ганда Х в растворе; q — число лигандов в комплексе; п — число электронов, участвующих в реакции восстановления.
Число лигандов в комплексе можно найти из наклона зависимости потенциала восстановления Мп2+ до Мп0 от логарифма концентрации лиганда по уравнению
0,059
х-~Ч-• (3)
АЕу/А[ёа
При экстраполяции зависимости к ^Сх = 0 (СХ =1 М) определяются значения Е0 и в комплекса:
0 _Ео ^М59!^
мет ком & г ♦
(4)
Вольтамперные кривые, полученные на стационарном ртутном электроде, регистрируются в виде волн с пиком, характеризующимся значением Ер. Для обратимого двухэлектронного процесса Ер—Еу = 14 мВ [33]. Мы использовали экспериментальные значения Ер вместо значений Еу для построения зависимости по уравнению (3).
Из зависимости Ер от lgC бикарбоната при рН 8,3 (рис. 1) видно, что добавление первых аликвот бикарбоната не изменяет потенциала восстановления Мп2+ до Мп0. Это указывает на пр
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.