БИОЛОГИЯМОРЯ, 2013, том 39, № 3, с. 213-218
УДК582.272.4 АЛЬГОЛОГИЯ
СОСТАВ И СТРУКТУРНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОЛИСАХАРИДОВ БУРОЙ ВОДОРОСЛИ EISENIA BICYCLIS1
© 2013 г. Р. В. Меньшова1, С. П. Ермакова1, Б. X. Ум2, Т. Н. Звягинцева1
'Тихоокеанский институт биоорганической химииДВО РАН, Владивосток 690022;
2Корейский институт науки и технологий, Каннын 210-340, Республика Корея e-mail.Menshova-R@yandex.ru
Статья принята к печати 22.11.2012 г.
Определен состав полисахаридов бурой водоросли Eisenia bicyclis. Показано, что основным полисахаридом этой водоросли (15.8% от массы обезжиренной водоросли) является альгинат натрия. Количество ламинарана составило 1.4% от массы обезжиренной водоросли, фукоидана - 1.3%. Показано также, что водоросль содержит ламинаран (1,3;1,6-Р-0-глюкан) уникальной структуры с высоким содержанием 1,6-связанных остатков глюкозы (соотношение 1,3 : 1,6 = 1.5 : 1) и необычно высокой молекулярной массой (19-27 кДа). Фракции фукоиданов из Е. bicyclis представляют собой сульфатированные и ацетилированные гетерополисахариды, различающиеся по степени сульфатирования и моносахаридному составу.
Ключевые слова: бурые водоросли, Eisenia bicyclis, полисахариды, ламинаран, фукоидан, альгинат.
Composition and structural characteristics of polysaccharides of the brown alga Eisenia bicyclis. R. V.
Menshova1, S. P. Ermakova1, B. H. Um2, T. N. Zvyagintseva1 ('Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, Far East Branch, Russian Academy of Sciences, Vladivostok 690022; 2Korea Institute of Science and Technology, Gangneung Institute, Gangneung 210-340, Korea)
The present study examines the polysaccharide composition of the brown alga Eisenia bicyclis. The major polysaccharide of E. bicyclis is sodium alginate (15.8% of the dry alga weight). The yields of laminaran and fucoidan were 1.4% and 1.3% of the dry alga weight, respectively. The alga is shown to contain laminaran (l,3;l,6-P-D-glucan) that has a unique structure with high content of 1,6-linked D-glucose residues (the ratio of 1,3 : 1,6 linkages is 1.5 : 1) and unusually high molecular weight (19-27 kDa). The fucoidan fractions isolated from E. bicyclis are sulfated and acetylated hetero-polysaccharides differing in the sulfate contents and sugar constituents. (BiologiyaMorya, 2013, vol. 39, no. 3, pp. 213-218).
Keywords: brown algae, Eisenia bicyclis, polysaccharides, laminaran, fucoidan, alginate.
Бурые водоросли являются богатым и возобновляемым источником биологически активных полисахаридов: альгиновых кислот, ламинаранов и фукоиданов. Эти соединения обладают широким спектром биологической активности и низкой токсичностью (Звягинцева и др., 1994, 2002; Усов, 1999; Kusaykm et al., 2008; Усов, Билан, 2009).
Бурая водоросль Eisenia bicyclis (Kjellman, 1885) Setchell, 1905 распространена у побережья Японии и Республики Корея. Она принадлежит к семейству Lessoniaceae порядка Laminariales и является источником полисахаридов уникальной структуры. Известно, что ламинараны из Е. bicyclis (1,3;1,6-Р-0-глюканы) характеризуются высоким содержанием 1,6-связанных остатков глюкозы (Maeda, Nishizawa, 1968). Было установлено, что ламинаран из бурой водоросли Е. bicyclis (молекулярная масса 6 кДа), собранной у тихоокеанского побережья Японии, имеет разветвленную структуру, соотношение связей 1,3 : 1,6 составляет 1.5 : 1 (Usui et al., 1979; Pang et al., 2005). Нами был выделен ламинаран из Е. bicyclis, собранной в мае (Японское море, Республика Корея), с молекулярной массой около 5 кДа и соотно-
шением связей 1,3 : 1,6 = 2.6 : 1 (Ermakova et al., 2013). Как правило, большинство исследованных водорослей синтезируют ламинараны с содержанием 1,6-связанных остатков глюкозы около 10% и молекулярной массой 3-6 кДа (Звягинцева и др., 1994).
Согласно литературным данным, фукоидан из Е. bicyclis (тихоокеанское прибрежье Японии) представляет собой высокосульфатированный (32.3%) фукан (Usui et al., 1980). Ранее из образца водоросли Е. bicyclis, собранной в мае (Японское море, Республика Корея), нами был выделен фукоидан со степенью сульфатирования 13.5%, содержащий помимо основного моносахарид-ного остатка фукозы небольшие количества галактозы, ксилозы и маннозы (Ermakova et al., 2013).
Известно, что содержание полисахаридов и их характеристики могут варьировать в зависимости от места и времени сбора водоросли (Honya et al., 1999; Zvyagintseva et al., 2003). Поэтому цели данной работы - выделение биологически активных полисахаридов из Е. bicyclis, собранной в июле 2010 г. у япономорского побережья Республики Кореи, изучение состава и структурных характеристик выделенных полисахаридов с
1 Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ № 12-04-00669-а, 12-04-31713-мол_а, ДВО РАН и программы "Молекулярная и клеточная био-
логия".
использованием химических и физико-химических методов, а также сравнение полученных результатов с литературными данными с учетом условий произрастания водоросли.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Реагенты и материалы. Этанол, гидроксид натрия, неорганические кислоты и соли - коммерческие препараты компании "Лаверна" (Россия); гидроксид аммония - фирмы "Вектон" (Россия); стандарты (манноза, рамноза, глюкоза, галактоза, ксилоза, фукоза, декстраны: 6,20,40, 80 кДа) - производства фирмы "Sigma" (США).
Носители для хроматографии: Полихром-1 - производство компании "Реахим" (Россия), Macro-Prep DEAE - "BioRad" (США), DEAE-целлюлоза - "Sigma" (США), Superdex 75 HR - "American Pharmacia Biotech AB" (США).
Бурая водоросль Eisenia bicyclis была собрана в июле 2010 г. у япономорского побережья Республики Кореи.
Экстракция низкомолекулярных веществ. Высушенную и измельченную водоросль обрабатывали 70% водным этанолом и ацетоном при температуре 23°С в течение 10 дней. Обезжиренную водоросль сушили на воздухе.
Выделение водорастворимых полисахаридов (рис. 1). 1250 г высушенной обезжиренной водоросли Е. bicyclis (Eb) экстрагировали 0.1 М раствором соляной кислоты (в соотно-
шении 1 : 20) в течение 2 ч при температуре 60°С; экстракцию проводили дважды. Экстракты объединили, нейтрализовали и сконцентрировали. Полисахариды осадили 96% этанолом (в соотношении экстракт : этанол =1:2), осадок промыли этанолом, ацетоном и высушили на воздухе. Получили препарат водорастворимых полисахаридов 1ЕЬР (11.7 г). Надосадочную жидкость сконцентрировали под вакуумом, полисахариды осадили 96% этанолом (в соотношении экстракт : этанол =1:4), осадок промыли этанолом, ацетоном и высушили на воздухе. Получили препарат 2ЕЬР (26.3 г).
Выделение альгината натрия (рис. 1). Навеску (5 г) остатка водоросли после выделения водорастворимых полисахаридов экстрагировали 2% раствором карбоната натрия (в соотношении 1 : 30) в течение 1 ч при температуре 55°С; экстракцию проводили дважды. Экстракты объединили, диализо-вали против дистиллированной воды, альгинат натрия осадили тремя объемами 96% этанола. Осадок последовательно промыли 96% этанолом, ацетоном и высушили на воздухе. Получили препарат альгината натрия ЕЬА (1.72 г).
Фракционирование ламинаранов и фукоиданов (рис. 1). Навеску (1 г) фракции 1ЕЬР растворили в 0.04 М НС1, центрифугировали, надосадочную жидкость нанесли на колонку с DEAE-целлюлозой (8.5 х 8 см). Нейтральные полисахариды элюировали водой, заряженные - ступенчатым градиентом NaCl (0.5 М, 1 М, 1.5 М) до отрицательной реакции элюата на общие сахара (Dubois et al., 1956). После диализа против
Рис. 1. Схема выделения полисахаридов (альгината, ламинаранов, фукоиданов) из Eisenia bicyclis.
дистиллированной воды фракции сконцентрировали под вакуумом и высушили лиофильно. Получили препараты ламина-рана (L) lEbL и фукоиданов (F) lEbFl, lEbF2 и lEbF3. 2ЕЬР фракционировали аналогичным образом, получили препараты ламинарана 2EbL и фукоиданов 2EbFl, 2EbF2 и 2EbF3.
Фракции lEbL и 2EbL растворили в воде, нанесли на колонку с Полихромом-1 (политетрафторэтилен, 65 х 7 см), колонку промыли сначала водой, затем 5% водным этанолом для отделения следовых количеств фукоидана. Ламинараны элюировали 15% водным этанолом до отрицательной реакции элюата на общие сахара (Dubois et al., 1956). Для отделения пигмента элюат пропустили через колонку Macro-Prep DEAE (8 х 2.5 см), сконцентрировали под вакуумом и лиофильно высушили. Выход ламинаранов lEbL и 2EbL составил 0.397 и 0.579 г соответственно. Выход фукоиданов lEbFl, lEbF2, lEbF3, 2EbFl, 2EbF2 и 2EbF3 составил 0.074, 0.182, 0.053, 0.049, 0.076 и 0.373 г соответственно.
Общее содержание Сахаров определяли колориметрически по реакции с фенолом и серной кислотой (Dubois et al., 1956) на спектрофотометре Cecil CE 1011 (Великобритания), используя в качестве стандарта глюкозу и фукозу.
Содержание белков определяли колориметрически по методу Брэдфорд (Bradford, 1976) на спектрофотометре для микропланшет Bio-Tek Instruments Power Wave™ (США), используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин.
Содержание полифенолов определяли колориметрически по методу Фолина-Чокальтеу (Singleton, Rossi, 1965) на спектрофотометре для микропланшет Bio-Tek Instruments Power Wave™ (США), используя в качестве стандарта флоро-глюцин.
Содержание сульфатов в полисахаридах определяли турбидиметрически (Dodgson, Price, 1962) на спектрофотометре для микропланшет Bio-Tek Instruments Power Wave™ (США), используя в качестве стандарта сульфат калия.
Молекулярно-массовоераспределение ламинаранов определяли на хроматографе GE Healthcare Acta FPLC (США) с кондуктометрическим детектором и коллектором фракций, используя аналитическую колонку Superdex 75 HR (1.5 х 30 см). Элюцию проводили 0.15 M NaCl в 0.05 M фосфатном буфере, рН 7.2, скорость элюции 0.2 мл/мин. Наличие Сахаров во фракциях выявляли с помощью фенолсернокислотного метода (Dubois et al., 1956). Для калибровки использовали глюкозу, ла-минариолигосахариды и декстраны с известной молекулярной массой 6,20, 40 и 80 кДа.
Кислотный гидролиз полисахаридов. 5 мг образца растворяли в 0.5 мл 2 M ТФУ. Гидролиз проводили при 100°С в течение 6 ч. Образцы нейтрализовали раствором водного аммиака и упаривали досуха.
Моносахаридный сост
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.