МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 84, № 2, с. 204-211
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 582.281
СОСТАВ ЛИПИДОВ В КЛЕТОЧНЫХ СТЕНКАХ И КЛЕТКАХ МИЦЕЛИЯ И СПОР МИЦЕЛИАЛЬНЫХ ГРИБОВ
© 2015 г. Е. П. Феофилова1, Я. Э. Сергеева, И. С. Мысякина, Д. А. Бокарева
Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук, Москва
Поступила в редакцию 03.04.2014 г.
В липидах клеточных стенок (КС), а также целых клеток мицелия и покоящихся клеток представителей мукоровых и аскомицетных грибов обнаружены количественные и качественные различия. Так, целые клетки мицелия (ЦК) содержали больше липидов, чем КС. В отличие от спор экзогенного покоя — спорангиоспор и конидий — наибольшее количество липидов, представленных три-ацилглицеринами (70%), содержали зиготы. Состав клеточных липидов мукоровых грибов содержал больше триацилглицеринов (ТАГ) и меньше полярных липидов, чем липиды аскомицетов. Все изученные КС и ЦК имели сходный состав жирных кислот (ЖК), однако их соотношение индивидуально для каждой структуры: в КС и ЦК мицелия преобладала линолевая кислота, а в спорах — олеиновая, что особенно заметно для ЦК конидий. Для КС, в отличие от ЦК, характерно то, что массивными липидами могут быть не фосфатидилэтаноламин (ФЭА) и фосфатидилхолин (ФХ), а свободные жирные кислоты (СЖК), стерины в свободной (ССт) и этерифицированной форме (ЭСт), фосфатидная кислота (ФК), метиловые эфиры ЖК (МЭЖК) и гликолипиды (ГЛ), что свидетельствует об особой функциональной значимости КС.
Ключевые слова: клеточная стенка, липиды, мицелиальные грибы, споры, мицелий.
DOI: 10.7868/S0026365615020044
Клеточная стенка (КС) мицелиальных грибов является структурой, функциональное значение которой оценили сравнительно недавно. К началу 2000-ых годов стало известно, что она выполняет, кроме каркасной, такие жизненно важные функции, как контроль морфогенеза и покоя, участие в процессах репродукции, определение антигенных и адгезивных свойств, диморфизм, скорость ростовых процессов и движение гиф по поверхности субстрата и др. [1—7].
Липиды выполняют не только барьерную функцию в клетке, но и в составе мембран участвуют в генерации энергии, контролируют передачу сигналов, репликацию ДНК и являются своеобразным "селектором" сигналов, воспринимаемых рецепторной системой, связанной с КС [8]. Исторически сложилось так, что наиболее интенсивно изучался углеводный состав КС грибов, в частности ее основные биополимеры — хитин и глюканы. По составу липидов КС грибов работ значительно меньше, и наши сведения в этой области ограничены, в основном, исследованиями липидного состава КС мицелия. Значимую информацию может дать сравнительное исследование изменений состава липидов КС и целых клеток (ЦК) при онтогенезе изучаемых мицелиаль-
1 Автор для корреспонденции (e-mail: feofilov@inmi.host.ru).
ных грибов, что может расширить наши представления о таких жизненно важных процессах, как ответ на стрессовые воздействия и переход к состоянию покоя.
Цель настоящей работы — изучение состава липидов клеточных стенок и целых клеток у представителей мукоровых и аскомицетных грибов на разных стадиях их развития — вегетативной (мицелий, спороносцы) и покоящейся (споры, зиготы).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объекты исследования. Работу проводили с мицелиальными грибами, представителями низших и высших грибов: 1) гетероталличными штаммами Cunninghamella echinulata (синоним — С.japónica), ВКМ F-470 (-), 471 (+), 776 (-), 775 (+), 626 (-), 1204 (-), C. homothalica ВКМ F-930 (семейство Cunninghamellaceae) и Absidia coerulea ВКМ F-858 (+) и 859 (—) (семейство Mucoraceae), относящимися к подотделу Mucoromycotina. Объектами исследования состава липидов являлись штаммы C. japonica 1204 (—) и Absidia coerulea; 2) Penicillium roqueforti ВКМ F-3057, относящийся к отделу Ascomycota, класс Eurotiomycetes, порядок Eurotiales, семейство Trichomaceae. Все штаммы получены из Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии
микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН. В ряде опытов использовали также Pénicillium lanosum и P. nigricans, полученные из музея культур кафедры микологии и альгологии Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.
Получение спорангиоспор, конидий, зигот проводили, как описано ранее [9].
Глубинное выращивание культур проводили на среде Гудвина с модификациями йланиной [10], (%): глюкоза — 5, нитрат аммония — 0.12, дрожжевой экстракт - 0.1, KH2PO4 - 0.1, MgSO4 • 7H2O - 0.025 [10]; скорость вращения качалки — 250 об./мин, температура — 27—28°С. В качестве инокулята использовали водную суспензию 7-суточных спор.
Выделение клеточных стенок проводили согласно ранее разработанными нами методами [11], для определения степени чистоты КС использовали световую и электронную микроскопию.
Экстракцию липидов из целых клеток и свободных липидов из выделенной клеточной стенки проводили по методу Фолча [12]. При экстракции целых клеток получали суммарные липиды клеточных стенок и цитоплазмы с органеллами. Содержание общих липидов в биомассе определяли гравиметрически.
Прочносвязанные липиды клеточной стенки получали из материала, оставшегося после извлечения легкоэкстрагируемых (свободных) липи-дов, путем гидролиза в смеси хлороформ-метанол (2 : 1), подкисленной концентрированной серной кислотой (1% по объему), в течение 3 ч [13].
Определение качественного и количественного состава индивидуальных фракций липидов. Состав фракций нейтральных (НЛ) и полярных липидов (ПЛ) анализировали методом восходящей тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинках с закрепленным слоем силикагеля марки "Merck" (Германия). Для разделения НЛ использовали системы растворителей: гексан-диэтиловый эфир-уксусная кислота (85 : 15 : 1) или петролейный эфир— диэтиловый эфир—уксусная кислота (80 : 20 : 2) [14]. Для разделения ПЛ использовали двумерную ТСХ: последовательно использовав в одном направлении систему хлороформ—метанол—вода (65 : 25 : 4), а во втором: хлороформ-ацетон-метанол-уксусная кислота—вода (50 : 20 : 10 : 10 : 5) [15]. На пластинку ("Merck", Германия) наносили 70—120 мкг липидов.
Идентификацию фракций проводили с использованием стандартных препаратов липидов, а также по специфическим качественным реакциям на отдельные функциональные группы [14]. С этой целью использовали: реактив Драгендорфа (на холин-содержащие липиды), раствор нингид-рина (на липиды со свободной аминогруппой), раствор а-нафтола ( на гликолипиды), смесь серной и уксусной кислот (на стерины). В качестве
универсального проявителя использовали раствор фосфорномолибденовой кислоты.
После идентификации липидных фракций для определения их количественного содержания проводили денситометрический анализ с использованием программ "Dens" и "Sorbfil" (Россия). В качестве стандартов для построения калибровочных кривых использовали стандартные растворы ФХ, ТАГ и СЖК ("Sigma", США).
Определение качественного и количественного состава жирных кислот. Для анализа жирных кислот получали их метиловые эфиры, для чего липиды подвергали кислотному метанолизу [14]. Контроль за ходом реакции осуществляли методом микротонкослойной хроматографии в системе гек-сан—диэтиловый эфир—уксусная кислота (80 : 20 : 1). Качественный и количественный анализ состава жирных кислот общих липидов гриба проводили на газожидкостном хроматографе Хроматэк Кристалл 5000.1 (Россия), снабженном капиллярной колонкой Optima-240 (0.25 мм-60 м-0.25 мкм; "MacherayNagel Gmbh&Co" (Германия), неподвижная фаза: 33% цианопропил-метил—67% диметилполиси-локсан), в программируемом режиме; температура колонки 130—280°C, скорость расхода газа-носителя (гелий) — 30 мл/мин. Жирные кислоты идентифицировали по относительному времени удерживания на колонке компонентов смеси в сравнении со стандартами. Степень ненасыщенности липидов выражали количеством двойных связей на 1 молекулу жирных кислот.
Обработка результатов проводилась с использованием метода медианы [13], а также с помощью пакетов программ STAtISTICA 6.0 ("StatSoft, Inc.") и Microsoft® Office Excel® 2003, Microsoft® Office Excel® 2007.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В результате проведенных исследований установлено, что количество биомассы для использованных в работе мукоровых грибов в трофофазе составляло 9—10 г/л, в идиофазе — 14—16 г/л, для P. roqueforti — в трофофазе — 6—7 г/л, в идиофазе — 16-19 г/л.
Содержание суммарных липидов целых клеток и клеточных стенок. В целых клетках активно растущего мицелия и зигот уровень липидов выше, чем в КС (рис. 1). Особенно это заметно для половых клеток A. coerulea, где количество липидов в целых клетках почти в два раза выше, чем в КС.
Иная закономерность свойственна другим клеткам грибов, находящимся в экзогенном покое — спорам. В этом случае содержание липидов у всех исследуемых грибов было более высоким в КС, что особенно ярко выражено для спорангиоспор C. japónica.
л о о св
s
о
и
VO H
о
л g
с
и Л
60 50 40 30 20 10
(а)
Л
л о о
а
s
о
и
VO
а
8 30 н о
60 50 40
20
Й 10 ид
§ 0 Л
Мицелий Споры
(б)
Мицелий
Споры
30
(в)
§ 50 б
g 40
е в
н
5 20 3 10
ид § 0
^н Мицелий Споры Зиготы
Рис. 1. Содержание липидов в ЦК (1) и КС (2) мицелия и спор Cunninghamella japonica (а), Pénicillium ro-queforti (б), Absidia coerulea (в).
Интересным представляется и тот факт, что у всех исследованных грибов в КС спороносцев также обнаружено высокое содержание липидов, представленных в основном триацилглицерина-ми. Так, содержание общих липидов в споронос-цах С. ]аротса достигало 27.0% и А. еоегыка — 22%. Отмеченную высокую липофильность спороносцев можно объяснить тем, что нейтральные липиды, помимо функции энергозапасаемого субстрата, участвуют в синтезе хитина, а именно этим аминополисахаридом очень богаты спороносцы. Для синтеза хитина необходим моногликозилди-ацилглицерин, который, возможно, выполняет функцию липидного "праймера" в синтезе хитина. Предполагают также, что именно хитин обеспечивает вертикальный рост спороносцев на поверхности субстрата[13, 16].
Состав и содержание индивидуальных фракций нейтральных липидов целых кле
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.