УДК 597.584.591.39
СОСТОЯНИЕ ГОНАД, ПОДВИЖНОСТЬ СПЕРМАТОЗОИДОВ И НАЧАЛЬНЫЕ СТАДИИ ЭМБРИОНАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ
UPENEUS TRAGULA (MULLIDAE) © 2015 г. Н. Г. Емельянова, Д. А. Павлов, Лыонг Тхи Бик Тхуан*, Во Тхи Ха*
Московский государственный университет * Приморское отделение Российско-Вьетнамского тропического научно-исследовательского и технологического центра — Нячанг, Вьетнам E-mail: enata744@mail.ru Поступила в редакцию 20.03.2014 г.
У тропического представителя семейства Mullidae Upeneus tragula описано развитие половых клеток, определена подвижность сперматозоидов и прослежены начальные стадии эмбрионального развития. В прибрежной зоне Вьетнама в зал. Нячанг у большинства половозрелых самок на протяжении всего года гонады находятся на IV, IV—V и VI—IV стадиях зрелости и характеризуются непрерывным типом оогенеза. Аномальное строение ооцитов отмечено у 15% исследованных самок. В зал. Халонг в декабре почти все половозрелые самки имеют гонады II стадии зрелости. У половозрелых самцов сперматозоиды наиболее многочисленны в удлинённых семяпроводах. Компьютерный анализ подвижности сперматозоидов, извлечённых из семяпровода и активированных морской водой, показал, что через 1 мин после активации скорость перемещения клеток составляет в среднем 53 мкм/с, а продолжительность поступательных движений не превышает 5 мин.
Ключевые слова: Upeneus tragula, Mullidae, оогенез, размерный состав ооцитов, сперматогенез, подвижность сперматозоидов, эмбриональное развитие.
DOI: 10.7868/S0042875215020071
Представители семейства Mullidae являются важными компонентами пищевых цепей в прибрежных экосистемах субтропической и тропической зон. Вследствие специфики пищевого поведения (перемешивание грунта посредством пары усиков на гиоидной дуге) рыбы участвуют в возвращении донных осадков и биогенов в окружающую среду и в привлечении других видов рыб, формируя многовидовые сообщества. Эти рыбы, обладающие широким ареалом, рассматриваются как индикаторы состояния донных биотопов (Овен, 2004; Uiblein, 2007; Rajan et al., 2012; Емельянова и др., 2014).
Upeneus tragula распространён в Индийском океане и западной части Тихого океана (30° с.ш.— 25° ю.ш.), во многих регионах достигает высокой численности и повсеместно является ценным объектом промысла. Биология этого вида исследована фрагментарно (McCormick, 1993, 1994; McCormick, Molony, 1993; Sabrah, El-Ganainy, 2009). Некоторые особенности размножения особей в тропической зоне описаны для прибрежных регионов Индии (Thomas, 1969). Приведены сведения по соотношению полов, размерному составу популяций и периодичности нереста U. tragula из южной части Центрального Вьетнама (зал. Нячанг) и Северного Вьетнама (зал. Халонг) (Pavlov
et al., 2014). Имеются данные по ультраструктуре овулировавших ооцитов и сперматозоидов особей этого вида (Емельянова, Павлов, 2012, 2014).
Развитие гонад U. tragula остаётся неисследованным, а особенности икрометания и осеменения овулировавших ооцитов составляют особую проблему. Самцы с семенниками на чётко выраженной V стадии зрелости в уловах не встречаются, а сперму, извлечённую из семенников, не удаётся активировать морской водой (Thomas, 1969; Pavlov et al., 2014). Сведения по эмбриональному развитию яиц в литературе отсутствуют.
Цель работы — исследовать гаметогенез (преимущественно оогенез) U. tragula в прибрежной зоне Вьетнама, провести эксперименты по активации спермы и с помощью компьютерного анализа проанализировать подвижность сперматозоидов, а также описать начальные стадии эмбрионального развития.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Материал собран в Южно-Китайском море в прибрежной зоне Вьетнама: в зал. Нячанг — на протяжении разных сезонов в 2008—2013 гг., в зал. Халонг — во второй половине декабря 2010 г. Работа проведена главным образом на базе Приморского
отделения Российско-Вьетнамского тропического научно-исследовательского и технологического центра (г. Нячанг, СРВ). В зал. Нячанг рыб для исследований отлавливали местные рыбаки с помощью легководолазного снаряжения и накидных сетей. Время от отлова до доставки живых рыб в лабораторию составляло несколько часов. Часть рыб непосредственно после доставки подвергали биологическому анализу с фиксацией фрагментов гонад; других особей в течение 2 сут. содержали в бассейне объёмом 4 м3 в садках из дели для стимуляции созревания и овуляции ооци-тов (5 экспериментов по 1G—15 экз.). Метод гормональных инъекций сурфагона не отличался от использованного ранее для индукции созревания и овуляции ооцитов полосатой зубатой барабули Parupeneus multifasciatus (Павлов и др., 2G11; Емельянова и др., 2G13). В зал. Халонг для биологического анализа использовали свежих особей из траловых уловов местных рыбаков. Рыбу получали в рыбном порту г. Ван Дон, расположенного к северо-востоку от г. Халонг. Места сбора материала обозначены в нашей предыдущей статье (Pavlov et al., 2G14).
Для гистологического исследования фрагменты гонад фиксировали в смеси Буэна. Гистологическая обработка гонад 8G самок и 22 самцов из зал. Нячанг длиной по Смитту (FL) 7—21 см проведена общепринятыми методами (Роскин, Ле-винсон, 1957). С целью изучения морфологии ооцитов, завершающих оогенез (in vivo), клетки конца периода вителлогенеза погружали в просветляющую жидкость Серра (Макеева, Емельянова, 199G), а ооциты периода созревания, приобретающие прозрачность, помещали в физиологический раствор. Исследовали ооциты 5 самок. Для анализа размерного состава ооцитов использовали фрагменты свежих гонад, помещённые в физиологический раствор. Сравнительный анализ распределения ооцитов по диаметру на протяжении зимнего сезона (декабрь—январь) приведён для популяций U. tragula из заливов Нячанг и Халонг, расстояние между которыми составляет более 1GGG км. Изображения клеток получали с помощью микроскопа Nikon Eclipse E-2GG и цифровой камеры Olympus SP-35G. Измерения диаметра ооцитов проведены с использованием компьютерной программы "ImageJ".
Сперму барабулевых рыб, извлечённую из фрагментов семенников, не удаётся активировать морской водой (Емельянова и др., 2G13; Pavlov et al., 2G14). Вместе с тем сперма, взятая из фрагментов удлинённых семяпроводов трёх самцов U. tragula, была подвижной после её помещения в морскую воду. Продолжительность поступательных движений сперматозоидов этих особей не превышала 4—5 мин. Подвижность сперматозоидов одного из самцов регистрировали посредством компьютерного анализа (Павлов, 2GG6). На
предметном стекле делали мазок спермы, взятой из измельчённого семяпровода, после чего сперму активировали каплей морской воды и накрывали покровным стеклом. Для видеозаписи использовали систему для анализа изображения, включающую микроскоп (об. х40, ок. х10), аналоговую видеокамеру и компьютер. Видеозапись подвижности сперматозоидов (в течение 10 мин при 25°C) начинали через 1 мин после активации спермы. В программе "Pinnacle studio" последовательно с периодичностью 0.5 мин сохраняли по 15 кадров видеозаписи, соответствующих регистрации перемещения клеток в течение 0.5 с. Скорость перемещения сперматозоидов по реальной криволинейной (VCL, curvilinear velocity) и прямолинейной (между начальной и конечной точками) траекториями (VSL, straight line velocity) определяли при помощи программы "ImageJ" (подпрограмма "MTrack2"). Степень прямолинейности движения сперматозоидов (LIN) определяли по формуле: LIN = VSL/VCL х 100. Число подвижных сперматозоидов быстро уменьшалось после активации спермы, в связи с чем число клеток с автоматически просчитанными траекториями составило от 186 (1 мин после активации) до 25 (6 мин после активации). Сперматозоиды со средним значением VSL < 3 мкм/с относили к неподвижным (Павлов, 2006).
Овулировавшие ооциты получены от одной из самок после гормональной стимуляции созревания. Для осеменения овулировавших ооцитов, отцеженных из тела самки, использовали измельчённые семяпроводы двух самцов. Методика искусственного осеменения описана ранее (Павлов и др., 2011). Икру инкубировали в чашках Петри при 25°C. Начальное развитие яиц исследовали на живых объектах.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Гистологическое состояние гонад. У самок ВЬ 7—8 см и массой около 7 г яичники находятся на II стадии зрелости, и основная масса половых клеток представлена превителлогенными ооци-тами (рис. 1а). Для ооцитов характерны гомогенная цитоплазма и округлое ядро, по периферии которого расположены ядрышки. У самок ВЬ > 8 см превителлогеннные ооциты постепенно увеличиваются в диаметре, достигая около 100 мкм. В более крупных клетках диаметром в среднем 120 мкм (п = 30) в околоядерной цитоплазме появляются мелкие вакуоли (жировые капли), которые постепенно по мере роста ооцита заполняют его центральную часть и могут располагаться на некотором расстоянии от ядра (рис. 1б). Яичники с такими ооцитами можно отнести к III стадии зрелости. В ооцитах начинается активный вител-логенез; гранулы желтка постепенно заполняют цитоплазму, оттесняя жировые капли обратно в
Рис. 1. Морфология ооцитов в яичниках разных стадий зрелости Upeneus tragula: а — ооциты периода превителлогенеза (II стадия зрелости); б — вакуолизированные ооциты в яичнике III стадии зрелости; в — заполненные желтком ооциты в яичнике IV стадии зрелости; г — фрагмент заполненного желтком ооцита; д — слияние жировых капель в ооцитах периода созревания (IV—V стадия зрелости); е — опустевший фолликул после овуляции (VI стадия зрелости). 1 — ядро, 2 — ядрышки, 3 — жировые капли, 4 — гранула желтка, 5 — фолликул. Масштаб: а, б, г, е — 50, в — 100, д — 200 мкм.
Рис. 2. Фрагменты семенника (а, б) и семяпровода (в) Upeneus tragula^. 1 — сперматогонии, 2 — сперматоциты I порядка, 3 — сперматозоиды. Масштаб. 50 мкм.
*
2
BKf/ лододт*
Ml
А4*
(а)
LS
3
Ш^ШШШ ш*
околоядерную зону (рис. 1в). В гонадах IV стадии зрелости кроме заполненных желтком ооцитов присутствуют вителлогенные клетки разного диаметра и разных фаз развития. Ооциты, завершившие вителлогенез, имеют диаметр около 350 мкм (рис. 1г). Такие клетки могут переходить к периоду созревания. Наиболее выраженные морфологические преобразования ооц
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.