БИОХИМИЯ, 2006, том 71, вып. 6, с. 786 - 797
УДК 577.112.855
СОСТОЯНИЕ ЯДРЫШКОВЫХ БЕЛКОВ В23/НУКЛЕОФОЭМИНА И UBF В КЛЕТКАХ HeLa ПРИ АПОПТОЗЕ, ИНДУЦИРУЕМОМ ФАКТОРОМ НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ*
© 2006 г. Е.Н. Сауткина, Н.А. Потапенко, Н.М. Владимирова**
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997Москва, ул. Миклухо-Маклая 16/10; факс: (495)335-7103, электронная почта: vla@ibch.ru
Поступила в редакцию 21.07.05 После доработки 06.02.06
Впервые оценено структурное состояние двух ключевых белков ядрышка UBF и В23/нуклеофозмина (как мономерных, так и олигомерных форм) при воздействии на клетки HeLa индукторов апоптоза: фактора некроза опухолей (TNF-a), эметина, а также их смеси. Выявлено, что обработка клеток как TNF-a, так и эметином не приводит к апоптозу и не влияет на состояние UBF и нуклеофозмина (как мономерных, так и олигомерных форм). Эффективный апоптоз клеток HeLa наблюдался только при воздействии смеси TNF-a и эметина. Проанализировано состояние UBF и белка В23 в образцах, содержащих 25, 45 и 100% клеток с апоптозными ядрами. Методом иммуноблотинга показано, что при TNF-a-индуцированном апоптозе клеток HeLa происходит протеолиз UBF c образованием 76 кДа-фрагмента, увеличение содержания которого коррелирует с долей клеток, подвергшихся апоптотическим изменениям. Охарактеризованы N- и С-конце-вые аминокислотные последовательности UBF и его 76 кДа-фрагмента, идентифицирована точка апоптоз-индуцированного специфического протеолиза. В отличие от UBF, белок В23 не подвергается протеолити-ческой деградации в ходе TNF-a-индуцированного апоптоза клеток HeLa и содержание белка не изменяется даже во фракции клеток, где практически все ядра фрагментированы. Однако в апоптотических клетках изменяется мономер-олигомерное состояние белка В23 и детектируются апоптоз-специфические формы нуклеофозмина.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: апоптоз, TNF, нуклеофозмин, UBF, протеолиз, олигомеры, HeLa.
Современные исследования показывают, что наряду с давно известными функциями (транскрипция рибосомных генов и биогенез рибосом) ядрышко играет важную роль в регуляции апоптоза — программируемой клеточной смерти [1—4]. Было установлено, что отличия раковых клеток от нормальных заключаются не только в гиперактивности и плеоморфизме ядрышек [3], но и в резком увеличении содержания ряда яд-рышковых белков, таких как В23^РМ/нуклео-фозмин, фибрилларин, UBF (NOR-90) [4], приводящем к повышению устойчивости опухолевых клеток к апоптозу. Было показано, что многие антираковые препараты, представляющие, как правило индукторы апоптоза, локализуются в ядрышке или изменяют ядрышковую структуру (сегрегация фибриллярных и гранулярных компонентов, аргентофильных белков, перемещение некоторых ядрышковых белков в нуклео-
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 6-06, 09.04.2006.
** Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
плазму), или ингибируют его функцию [1, 2]. Появилось сообщение [5], что ядрышко функционирует как стрессовый датчик, ответственный за поддержание низкого уровня белка р53, количество которого автоматически увеличивается сразу за деструкцией ядрышковой структуры и функции, обусловленной стрессом.
Предметом нашего исследования стали два ключевых белка ядрышка, несомненно вовлеченные в процесс апоптоза: В23/нуклеофозмин (фактор сборки пре-рибосом) и иВБ (транскрипционный фактор РНК-полимеразы I). Концентрация обоих белков резко возрастает в опухолевых клетках, их сверхэкспрессия понижает чувствительность клеток к факторам, вызывающим апоптоз [6]. Установлено, что цито-токсичность большого числа апоптотических агентов для опухолевых клеток коррелирует с их способностью индуцировать транслокацию белка В23 из ядрышка в нуклеоплазму [7—9] и активировать транслокацию/протеолиз иВБ [10—13].
Транслокация нуклеофозмина из ядрышка является начальной стадией ядрышковой сегре-
гации. По мнению некоторых авторов [3] этот процесс делает ядрышковую ДНК уязвимой для атаки нуклеазами. Действительно, транслокация белка В23 опережает такие события, как конденсация хроматина и фрагментация ДНК и может служить пусковым механизмом как для включения процессов репарации ДНК, так и для активации гена белка p53 и индукции апоп-тоза. Предполагается, что транслоцированный нуклеофозмин удерживает белок p53 в нуклео-плазме, стабилизируя его [5]. Ген нуклеофозми-на вовлечен в ряд хромосомных транслокаций, которые приводят к образованию гибридных (fusion) белков. Известно, что белки (NPM-ALK, NPM-RAR и NPM-MLF1) ответственны за возникновение лейкоза и предполагается, что изменение функций В23, вызванное образованием таких молекул, также может быть одной из причин неправильной регуляции функции р53 в опухолевых клетках [14]. В последнее время появились сведения о взаимодействии нуклеофоз-мина с двумя другими белками — супрессорами опухолевого роста: интерферонрегулирующим фактором-1 (IRF-1) [15] и интерферониндуци-руемой РНК-зависимой протеинкиназой (PKR) [16].
Появились новые литературные данные [4], что апоптозопосредованные изменения структуры ядрышковых белков (в частности, UBF и В23) являются пусковым механизмом для выработки аутоиммунных антител и служат причиной ряда аутоиммунных заболеваний. Что же известно об апоптоззависимых изменениях структуры UBF и нуклеофозмина? Большинство имеющихся литературных данных свидетельствует о том, что UBF является ранней мишенью апоптоза, причем помимо его транслокации из ядрышка в нуклеоплазму, происходит его апоптоззависимый протеолиз [17—21]. К сожалению, ни в одной из этих работ не были определены участки расщепления полипептидной цепи и охарактеризованы на структурном уровне его протеолитические фрагменты. Практически нет данных о мономер-олигомерном состоянии белка В23 в ходе апоптоза опухолевых клеток и даже данные об изменении концентрации белка В23 при апоптозе весьма противоречивы. В одних исследованиях при индукции апоптоза наблюдалось уменьшение содержания белка В23, связанное либо с уменьшением количества мРНК нуклеофозмина [3, 7], либо с его протеолизом [2, 8, 9]. Причем, как и в случае с UBF, это может быть не только каспазо-зависимый протеолиз [17—20] и множество работ сегодня направлено на поиск протеаз, активных в ядре при апоптозе. В других исследованиях показано, что содержание белка В23 не
изменяется [1, 10, 12, 13], происходит лишь его транслокация, коррелирующая с глубиной апоптоза. К сожалению, во всех этих работах оценивалась лишь мономерная форма белка. Однако появились данные [4, 14, 22], что малиг-незация клеток сопровождается структурными изменениями нуклеофозмина, приводящими к образованию уникальных олигомерных (преимущественно гексамерных) форм белка в опухолевых клетках, обладающих необычайно высокой устойчивостью к нагреванию и обработке Ds-Na. В настоящее время нет данных об изменении олигомерного состояния белка В23 в ходе апоптоза опухолевых клеток, где изменяется, в частности, его клеточная локализация и белки-партнеры.
В данной работе впервые проанализировано состояние нуклеофозмина (как мономерных, так и олигомерных форм) и охарактеризован на белковом уровне иВБ и продукт его протеолиза при TNF-a/эметининдуцированном апоптозе клеток карциномы шейки матки (ИеЬа).
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалы исследования. В работе были использованы: 10% эмбриональная бычья сыворотка, культуральная среда DMEM («Hy Clone», США); пенициллин, стрептомицин («Gibco», Великобритания); 5-диметиламинонафталин-1-сульфонилхлорид (Dns-Cl) («Fluka», Швейцария); эметин, калибровочные белки-стандарты (SDS-6H), NaCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4, динат-риевая соль ЭДТА, ацетонитрил, 3,3'-диаминобен-зидин (ДАБ), козьи антитела к IgG и IgM (H + L) мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена, овечьи антитела к IgG человека, конъюгиро-ванные с пероксидазой хрена, дигидрохлорид DAPI (дигидрохлорид 4', 6-диамидино-2-фенил-индола), параформальдегид, БСА, тимидин, карбоксипептидаза А (cp A), обработанная PMSF, из поджелудочной железы быка (активность 50 ед./мг белка), поливинилпиролидон-40 (PVP-40), пуромицин («Sigma», США); реком-бинантный TNF-а человека, любезно предоставленный лабораторией инженерии белка ИБХ РАН; реактивы для электрофореза, сухое обезжиренное молоко, Tris («Bio-Rad», США); Ds-Na («Bio-Rad») был перекристаллизован дважды из 95% метанола; мембраны иммобилона NC и иммобилона Р с диаметром пор 0,45 мкм («Millipore», США); моноклональные антитела к белку В23 (3С9), полученные в Гематологическом научном центре РАМН; аутоиммунная сыворотка больной системной склеродермией, полученная в Институте ревматологии РАМН;
Тритон Х-100, ДМСО («ICN», США); мовиол («Hoechst», США); остальные реактивы отечественного производства квалификации х.ч. или ос.ч.
Культуры клеток. В работе использовали культуры клеток человека HeLa и HeLa-Bcl-2 (полученные в Институте полиомиелитов и вирусных энцефалитов РАМН трансфекцией клеток HeLa вектором pLPS-bcl-2). Клетки выращивали на среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки и антибиотики (10 мкг/мл пенициллина и 10 мкг/мл стрептомицина) при 37° в присутствии 5% СО2. В случае клеток HeLa-Bcl-2 среда содержала дополнительно пуромицин (1 мкг/мл). Клетки для экспериментов выращивали в культуральных флаконах или на покровных стеклах.
Индукция апоптоза. Эксперименты проводили на вторые сутки после пересева, когда клетки находились в экспоненциальной фазе роста. Клетки инкубировали в присутствии ингибитора синтеза белков эметина (1 мкг/мл) или фактора некроза опухолей-а (TNF-a) (10 нг/мл) или их смеси при 37° в течение 2 и 6 ч. Контрольные клетки инкубировали в тех же условиях, но без эметина и TNF-a. Количество апоп-тотических клеток определяли путем подсчета числа клеток на трех случайно выбранных полях зрения микроскопа, используя объектив 40Х до и после воздействия соответствующих агентов. Идентификацию клеток, вступивших в апоптоз, проводили визуальным наблюдением в световой микроскоп, и с помощью окраски красителем DAPI по наличию характерных морфологических изм
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.