БИОФИЗИКА, 2015, том 60, вып. 1, с. 95-101
= БИОФИЗИКА КЛЕТКИ= =
УДК 577.3
СОСТОЯНИЯ ЛИПИДНЫХ ПОР В БИСЛОЙНЫХ ЛИПИДНЫХ МЕМБРАНАХ ПРИ ФАЗОВОМ ПЕРЕХОДЕ В РАСТВОРЕ LiCl С ДОБАВЛЕНИЕМ МОЛЕКУЛ ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЯ
© 2015 г. А.А. Аносов* **, М.С. Куприянова**, О.Ю. Немченко**, В.П. Норик**,
Е.В. Сергеенко**, Е.Ю. Смирнова**
*Институт радиотехники и электроники РАН им. В.А. Котельникова, 125009, Москва, ГСП-3, ул. Мох овая, 11;
**Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова, 119992, Москва, ул. Б. Пироговская, 2/6 E-mail: anosov@hotmail.ru Поступила в p едакцию 08.04.14 г.
Экспериментально исследована статистика времен открытого и закрытого состояний липидных пор в плоских бислойных липидных мембранах из дипальмитоилфосфатидилхолина при температуре фазового перехода в 1 М растворе LiCl при добавлении водорастворимых молекул полиэтиленгликоля различной молекулярной массы. Измерены трансмембранные импульсы тока в режиме фиксации напряжения (50 мВ). Гистограмма длительности импульсов и гистограмма межимпульсных интервалов имеют не экспоненциальный характер, а выраженный характерный максимум. Это означает, что регистрируемая в условиях фазового перехода последовательность импульсов трансмембранного тока является зависимой: появление новых импульсов зависит от того, когда возникали предыдущие; момент окончания импульса зависит от момента его начала. Предложенная модель Эрланга достаточно точно аппроксимирует экспериментальные гистограммы. Следуя модели, можно говорить о том, что липидная пора имеет несколько открытых и закрытых состояний.
Ключевые слова: фазовый переход, время жизни поры, межимпульсный интервал, бислойная липидная мембрана, ПЭГ.
Авторы исследований липидных пор, возникающих при различных физических и химических воздействиях на бислой, отмечают аналогию между липидными и белковыми ионными каналами и делают предположения, что некоторые свойства мембран, тр адиционно приписываемые белковым ионным каналам, могут быть связаны с липидной частью этих мембран. Например, регистр ир уемые токи сквозь липид-ные поры, возникающие при фазовых переходах гель-жидкокр исталлическое со стояние [1-5], под действием электрического поля (при обра -тимом пробое) [6] имеют ярко выраженный дискретный характер, как и токи, протекающие через белковые ионные каналы, а также похо -жие значения амплитуд и времен открытых состояний (миллисекундный диапазон).
Известно, что в точке фазового перехода липидов резко возр астает пр оницаемость мембраны и происходит увеличение электрической
Сокращения: ПЭГ - полиэтиленгликоль, ДПФХ - дипаль-митоил^п-глицеро-3-фосфохолин.
проводимости, что не кажется удивительным. Удивительно, что это увеличение пр оницаемо-сти приводит к появлению отчетливо выраженных дискретны х импульсов тока, котор ое связывается с появлением в липидном бислое гидрофильных пор. Появление аналогичных дискретных скачков тока вызывается также наложением электрического поля [6]. Амплитуды скачков проводимости измерены на большом количестве мембран из р азных липидов и со -ставляют от 10 пСм [3] до 20 нСм [7]. Что касается кинетических характеристик, то законы распределения времен открытых и закрытых состояний мало изучены, и до сих пор нет убедительного объяснения ярко выраженного дискретного характера этих скачков. Путь к объяснению лежит в изучении статистики вр е-мен открытого и закрытого со стояний предпо -лагаемого липидного канала-поры.
Кинетические хар актеристики пор (токовых скачков), возникающих в липидном бислое под действием кратковременных электрических импульсов, рассматривались в работе [6]. Характер наблюдаемых флуктуаций позволил авторам
предположить, что открытие и закрытие пор проходит через некоторое «электрически невидимое» активированное промежуточное состояние, названное авторами «препора». В работе [4] изучалось распределение времен открытых и закрытых состояний липидных пор, возникающих в липидном бислое при фазовом переходе и электр опорации. Отмечается неэкспоненциальное распр еделение этих времен, на о снования анализа предполагается наличие нескольких промежуточных, электрически невидимых состояний липидной поры.
В двух упомянутых работах общим подхо-дом является использование статистического анализа временных записей трансмембранного тока при постоянном напряжении на мембране. При этом по записям невозможно отличить интактный бислой от бислоя в квазиоткрытом (препо ра) или квазизакрытом со стоянии: уро -вень тока не меняется. Выводы о наличии таких состояний пор сделаны на основе анализа распределений времен жизни пор в открытом и закрытом состояниях.
В этой р аботе мы также будем придерживаться предлагаемого подхода. Мы будем рассматривать статистику вр емен открытого и закрытого состояний предполагаемых липидных каналов-пор, возникающих при фазовом переходе в присутствии водорастворимых полимеров полиэтиленгликоля (ПЭГ). В области фазового перехода часто наблюдаются состояния с несколькими каналами. Анализ таких записей с точки зрения длительностей проблематичен. Ранее мы показали, что наличие ПЭГ определенным обр азом стабилизир ует мембрану в условиях фазового перехода, скачки тока редки и практически не наблюдается двойных и тройных скачков [7,8]. В этих работах мы исследовали р аспределения амплитуд импульсов тока, определяемых размерами липидных пор, возникающих при фазовом переходе в плоском бислое. Целью настоящего исследования является анализ временных характеристик импульсов тока: распределение времени жизни поры в открытом и закрытом состояниях.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Липиды, ПЭГ, электролиты. Для изготовления плоских бислойных липидных мембран использовался 1,2-дипальмитоил-^и-глицеро-3-фосфохолин (ДПФХ) (Avanti Polar Ыр1ё8, Alabaster). В качестве омывающего раствора электролита использовался водный раствор 1М LiCl (рН 6,9). В ра створ добавляли глицер ин и полимер ы ПЭГ-300, ПЭГ-600, ПЭГ-6000 и ПЭГ-20000 (Sigma, США).
Плоские бислойные липидные мембраны
формировали по методу Мюллера и др. [9] на отверстии в стенке тефлонового стаканчика площадью 1 мм2. Мембр аноформирующий раствор содержал 25 мг ДПФХ в смеси декан-хлороформ-метанол (7:2:1 по объему).
Электрические измерения. Трансмембранный ток регистрировали с помощью пары А§-А§С1-электр одов, помещенных в р аствор электролита по обе стороны мембраны в режиме фиксации напряжения, равного 50 мВ, с помощью прибора для измерения малых токов (Пу-щино, Россия). Флуктуации тока записывали с помощью аналого-цифрового преобразователя (частота дискретизации 80 Гц). Детали измер е-ний описаны ранее [2,10].
Схема опыта. Плоские бислойные липидные мембраны формировали при температур е 50°С (выше температуры фазового пер ехода ДПФХ), после чего температур у в кювете снижали со скоростью 0,5°С в минуту. Записывали флуктуации тока, возникающие в области температуры основного фазового перехода. Мембраны формировали в растворе 1 М ЫС1, содержащем 20% соответствующего ПЭГ (по весу). Измер е-ния проводили в симметричных условиях.
Модель. Гистограммы плотности относительных частот для времени жизни поры и для межимпульсного интервала приближали распределением Эрланга [11]:
f(t) = tk-1
ехр
( t> 0
/ 0k(k - 1)!,
(1)
где параметр к показывает количество случайных процессов, следующих один за другим, пока не происходит интересующее нас событие, а 9 - среднее время, характер изующее пр отекание одного пр оцесса; в модели Эр ланга длительности процессов считаются одинаковыми. Среднее значение с помощью параметров Эр-ланга определяется по формуле:
mean = k0,
(2)
а среднеквадратическое отклонение - по формуле:
std = Vk0.
(3)
Отметим, что распределение Эрланга используется при обработке временных характеристик молекулярных процессов. Например, в работе [12] с помощью силовой спектроскопии исследовали разворачивание молекулы титин киназы. Измеренную гистогр амму времени разворачивания молекулярной структур ы пр ибли-жали распределением Эрланга.
1 нА
1 с
Глицерин
VI |У< Ь'.
пэг-зоо
л
I
ПЭГ-600
/к
ПЭГ-6000
А*
Ц-Л
ПЭГ-20000
Рис. 1. Флуктуации тока, записанные в режиме фиксированного напряжения 50 мВ, в бислойных липидных мембранах из ДПФХ в 1 М ЫС1 при добавлении глицерина и ПЭГ различных молекулярных масс. Записи получены пр и темпер атур е фазового пер ехода ДПФХ.
Р ЕЗУЛЬТАТЫ
Данные, пр едставленные на р ис. 1, получены в опытах с бислойными липидными мембр ана-ми из ДПФХ, сфо р мир ованными в 1 М водном р а створе ЫС1 пр и добавлении ПЭГ возр а стающей молекуляр ной массы. Записи получены пр и темпер атур е фазового пер ехода ДПФХ. В условиях экспер имента темпер атур а мембр аны постепенно снижалась, и время нахождения в состоянии фазового перехода составляло около 2 мин. На рис. 1 приведены записи тока в течение 20 с. На каждой из них видны импуль-
сы , которые соответствуют появлению пор. Анализ амплитуд импульсов, зависящих от массы ПЭГ в раствор е, пр оведен в работах [2,7,8]. В данной работе мы исследовали временнь!е характеристики последовательности импульсов, а именно время нахождения поры в открытом состоянии и длительность межимпульсного интер вала. Полученные данные для р азных ПЭГ и глицер ина пр иведены в таблице. Всего на -блюдали 328 пор в 72 мембранах, при этом получили 256 межимпульсных интер валов: количество интервалов, зарегистрированных в одной мембране, равно количеству пор в мем-
Влияние ПЭГ на вр еменные хар актер истики последовательности импульсов
Глицер ин ПЭГ-300 ПЭГ-600 ПЭГ-6000 ПЭГ-20000 С умма Среднее
Число мембр ан 13 24 7 25 3 72
Число пор 49 96 28 143 12 328
Среднее число пор на одной мембране 3,8 4 4 5,7 4 4,3 ± 0,8
Количество межимпульсных интервалов 36 72 21 118 9 256
Вр емя жизни, с 0,8 ± 0,7 0,5 ± 0,3 0,5 ± 0,1 0,5 ± 0,1 0,6 ± 0,2 0,5 ± 0,2
Межимпульсный интер вал, с 18 ±9 25 ± 10 22 ± 5 19 ±6 24 ± 10 21 ±8
Вр емя релаксации (минимум), с 68 100 88 108 96 92 ± 15
П р имечание. Бислойные липидные мембр аны из ДПФХ находились в 1 М ЫС1, рН 6.9, пр и темпер атур е фазового пер ехода. ПЭГ добавляли симметр ично в концентр ации
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.