БИОХИМИЯ, 2006, том 71, вып. 7, с. 996 - 1001
УДК 577.218
СОВМЕСТНАЯ ЭКСПРЕССИЯ ВСЕХ КОМПОНЕНТОВ ХОЛЕСТЕРИНГИДРОКСИЛАЗНОЙ/ЛИАЗНОЙ СИСТЕМЫ В КЛЕТКАХ Escherichia coli*
© 2006 г. Т.В. Шашкова**, В.Н. Лузиков, Л.А. Новикова
НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, 119992 Москва; факс: (495)939-3181, электронная почта: tshashkova@yandex.ru
Поступила в редакцию 06.02.06 После доработки 29.03.06.
На основе вектора pTrc99A/P450scc сконструирована плазмида, в которой кДНК цитохрома P450scc, адре-нодоксинредуктазы и адренодоксина находятся в составе одной экспрессионной кассеты. Показано, что в клетках Escherichia coli эта плазмида направляет синтез всех указанных выше белков. Установлена их внутриклеточная локализация и определено стехиометрическое соотношение. Отмечено, что клеточные гомо-генаты обладают холестерингидроксилазной/лиазной активностью, обусловленной наличием каталитически активных форм всех трех белков. Впервые синтезирован полный набор индивидуальных компонентов холестерингидроксилазной/лиазной системы млекопитающих в бактериальной клетке.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: цитохром P450scc, адренодоксин, адренодоксинредуктаза, коэкспрессия, E. coli.
Превращение холестерина в прегненолон — первая и скоростьлимитирующая стадия биосинтеза стероидных гормонов. Эта реакция осуществляется в митохондриях коры надпочечников цитохромом Р4508ее, который получает электроны от МАОРИ через два интермедиата — флавопротеин АдР и железосерный белок Ад [1].
Цитохром Р4508СС — интегральный белок внутренней митохондриальной мембраны, ориентированный в ней таким образом, что его активный центр обращен в сторону матрикса. Таким образом, цитохром Р4508СС доступен для взаимодействия с Ад — растворимым белком митохондриального матрикса [1]. Ад, в свою очередь, взаимодействует с АдР, которая обнаруживается как в матриксе, так и во внутренней митохондриальной мембране [2].
Стехиометрия компонентов ХГ/Л-системы в настоящее время окончательно не определена. В работе [3] показано, что Р4508СС, АдР и Ад присутствуют в митохондриях коры надпочеч-
Принятые сокращения: Ад — адренодоксин, АдР — адренодоксинредуктаза, ДТТ — 1,4-дитиотреитол, ИПТГ — изопропил-Р-Б-тиогалактозид, УСР — участок связывания рибосомы, ФМСФ — фенилметансульфонилфторид; ХГ/Л — холестерингидроксилаза/лиаза, P450scc — цитохром P450scc.
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 06-030, 11.06.2006.
** Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
ников быка в соотношении 2,9 : 1 : 7,7, а в работе [4] приводится соотношение 8 : 1 : 3.
Несмотря на интенсивные исследования ХГ/Л-системы в предыдущие годы, многие принципиально важные аспекты ее формирования и функционирования оставались неясными. Это, в частности, касается ее стехиометрии и возможности существования функционирующего тройного комплекса Р4508СС • Ад • АдР [5, 6]. Одним из путей выяснения этих вопросов может быть использование трансгенных дрожжей и бактерий с регулируемым уровнем экспрессии компонентов системы ХГ/Л.
К настоящему времени известна одна работа, в которой рассмотрена совместная экспрессия зрелых форм цитохрома Р4508СС, АдР и Ад в дрожжах Басскагошусев сегеу1з1ае [7]. Такие трансгенные дрожжи способны трансформировать эргоста-5-енеол в прегненолон и прогестерон. Однако упомянутая работа не проливает свет ни на проблему регуляции стехиометрии полиферментной системы, ни на механизм ее функционирования.
Принципиально иной подход к гетерологи-ческой экспрессии ХГ/Л-системы состоит в конструировании слитых белков, построенных из цитохрома Р4508СС, АдР и Ад как отдельных взаимодействующих каталитических доменов. Исследования, проводимые в этом направлении авторами работы [8], позволили установить наличие лишь каталитической активности слитого
белка, построенного из компонентов ХГ/Л-сис-темы, при его синтезе в клетках COS-1. В более поздних работах [9, 10] было показано, что при экспрессии в клетках Escherichia coli слитая ХГ/Л, в которой каталитические домены связаны короткими (2—5 аминокислотных остатков) линкерами, обладает низкой каталитической активностью по сравнению с системой, реконструированной из ее индивидуальных компонентов. По крайней мере отчасти это объяснялось стери-ческими затруднениями взаимодействия каталитических центров отдельных доменов.
Цель настоящей работы — создание вектора, позволяющего одновременно экспрессировать кДНК P450scc, АдР и Ад в клетках E. coli. Решение этой задачи позволит получить удобный инструмент для изучения каталитических свойств ци-тохрома P450scc и особенностей его функционирования в гетерологических системах и, возможно, создать трансгенные бактериальные клетки, эффективно трансформирующие холестерин и/или его аналоги в прегненолон.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе были использованы: 22R-гидрокси-холестерин, S-аминолевулиновая кислота, глю-козо-6-фосфат, дегидрогеназа глюкозо-6-фос-фата, холестериноксидаза, NADP+, ИПТГ, о-ди-анизидин, конъюгат антикроличьих антител с пероксидазой хрена («Sigma», США); эндонук-леазы рестрикции, фрагмент Кленова, Т4-ДНК-полимераза, Т4-ДНК-лигаза и набор реактивов для элюции ДНК («Fermentas», Литва). LB- и TB-среды для выращивания бактериальных клеток готовили из реактивов фирмы «Difco» (США). Для переноса белков использовали нит-роцеллюлозные фильтры фирмы «Amersham» (США) марки Hybond-C extra.
Первичные антитела к цитохрому P450scc, АдР и Ад быка, а также P450scc, АдР и Ад, выделенные из коры надпочечников быка [6, 11], были предоставлены В.М. Шкуматовым (Институт физико-химических проблем БГУ, Беларусь), набор реактивов для определения содержания прогестерона методом иммуноферментного анализа (ELISA) — А.Г. Прядко (Институт биоорганической химии АН Беларуси, Беларусь).
Бактериальный штамм и плазмиды. В работе использовались клетки E. coli штамма JM-109 («Promega», США) и вектор pTrc99A с гибридным trp/lac(trc)-промотором [12]. Плазмида pTrc99A/P450scc, содержавшая кДНК зрелого цитохрома P450scc быка [13], была любезно предоставлена М.Р. Ватерманом (University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, USA).
Исходным вектором для конструирования плазмиды для совместной экспрессии трех белков ХГ/Л-системы была плазмида pTrc99A/ /P450scc/Anp, содержавшая кДНК цитохрома P450scc быка и адренодоксинредуктазы человека в составе одной экспрессионной кассеты. Для ее создания использовали две исходные плазмиды с кДНК индивидуальных белков (pTrc99A/P450scc и pTrc99A/An;P), сконструированные ранее в нашей лаборатории.
Из плазмиды рТгс99А/АдР вырезали нуклео-тидную последовательность, кодирующую АдР и находящийся перед ней УСР, с помощью рест-риктаз Sse83871и MbiI. Этот фрагмент клонировали в плазмиде pTrc99A/P450scc, из которой был вырезан небольшой фрагмент по сайтам Sse8387I и SmaI, таким образом, что УСР и кДНК АдР встроились в кассету экспрессии после кДНК цитохрома P450scc.
Для экспрессии кДНК Ад в составе одной транскрипционной единицы с кДНК АдР и цитохрома P450scc вектор pTrc99A/P450scc/AдР обработали эндонуклеазой Sse8387I и Т4-ДНК-полимеразой. Из плазмиды pTrc99A/Aд, сконструированной ранее в нашей лаборатории, вырезали последовательность, кодирующую зрелый адренодоксин человека вместе с предшествующим УСР, с помощью рестриктаз PstIи MbiI, обработали полученный фрагмент Т4-ДНК-по-лимеразой и встроили его в вектор.
Трансформацию клеток E. ^li проводили методом электропорации. Полученная реком-бинантная плазмида (рис. 1) была достаточно стабильной. Способность содержащего ее штамма синтезировать указанные белки сохранялась в течение девяти месяцев.
Для экспрессии рекомбинантных белков клетки из индивидуальных колоний выращивали в течение ночи в среде LB, содержавшей ампициллин (250 мкг/мл), затем разводили средой TB в 200 раз и культивировали при 37° в течение 3—4 ч. Для индукции синтеза рекомбинантных белков в среду роста добавляли ИПТГ до конечной концентрации 1 мМ. После индукции экспрессии клетки культивировали в присутствии ампициллина (100 мкг/мл) и S-аминолевулиновой кислоты (0,5 мМ) в течение 48 ч при 22—24° при постоянном перемешивании (140 об/мин).
Фракционирование клеток E. coli. Клетки собирали центрифугированием (7500 g, 10 мин, «Beckman» J2-21, США), промывали буфером, содержавшим 10 мМ Hepes (pH 7,2), 150 мМ NaCl, 5 мМ MgSO4. Полученный после второго центрифугирования (7500 g, 10 мин) осадок суспендировали в 20 мМ Na-фосфатном буфере (pH 7,4), содержавшем 5 мМ MgSO4, 0,2 мМ ФМСФ, 4 мМ ДУТ Клетки разрушали с исполь-
Промотор
ori E. coli
bla
УСР
NADPH-генерирующей системы (конечные концентрации: 2 мМ NADP+, 10 мМ глюкозо-6-фосфата и 1 ед. на 1 мл дегидрогеназы глюкозо-6-фосфата). Образовавшийся прегненолон окисляли в прогестерон с помощью холестерин-оксидазы, стероиды экстрагировали этилацета-том, осадок, полученный после упаривания экстрактов на вакуумном испарителе (Speed Vac Concentrator, «Savant», USA), растворяли в буфере согласно протоколу, приведенному в работе [14]. Содержание прогестерона определяли с помощью набора для иммуноферментного анализа «ИФА-ПРОГЕСТЕРОН».
Другие методы. Разностный СО-спектр ци-тохрома P450scc регистрировали в гомогенате клеток E. coli, экспрессирующих компоненты ХГ/Л-системы. К пробе клеточного гомогената добавляли дитионит натрия, и с помощью спект-
Терминатор
Рис. 1. Схема плазмиды рТгс99Л/Р4508сс/АдР/Ад, содержащей кДНК цитохрома Р450всс, АдР и Ад в составе одной кассеты экспрессии
зованием пресса Френча (максимальное давление 16 000 psi).
Неразрушенные клетки и клеточный дебрис удаляли центрифугированием (31 000 g, 40 мин). Супернатант подвергали высокоскоростному центрифугированию (150 000g, 2,5 ч, ротор SW50, «Beckman» L2-65 B, США). Осадок суспендировали в 50 мМ Na-фосфатном буфере (pH 7,0). Полученный супернатант рассматривали как цитоплазматическую фракцию, а осадок — как фракцию вывернутых мембранных частиц.
Обе фракции подвергали Ds-Na-ПААГ-электрофорезу в 10- или 15%-ном ПААГ и им-муноблоттингу с использованием антисывороток (IgG-фракц
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.