ЖУРНАЛ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2007, том 62, № 3, с. 281-286
^=ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 543.544
СОВМЕСТНОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВОДО- И ЖИРОРАСТВОРИМЫХ ВИТАМИНОВ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ВОДНО-МИЦЕЛЛЯРНОЙ
ПОДВИЖНОЙ ФАЗЫ
© 2007 г. Л. А. Карпова, О. А. Королева
Санкт-Петербургский государственный университет 198504 Санкт-Петербург, Петродворец, Университетский просп.., 26 Поступила в редакцию 06.08.2005 г., после доработки 28.06.2006 г.
Методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии с применением фракционного элюи-рования показана возможность разделения жирорастворимых витаминов А и Е и водорастворимых витаминов группы В (В1; В2, Вб и В12). В качестве первой подвижной фазы использовали бензол; вторым элюентом служил водно-мицеллярный раствор додецилсульфата натрия (0.02 М).
Метод высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ) в настоящее время активно используется для качественного и количественного анализа органических и неорганических соединений в фармакологии, биохимии и медицине благодаря своим неоспоримым преимуществам по сравнению с классической ТСХ: экспрессно-сти и высокой эффективности разделения веществ различных классов [1-3].
Один из недостатков метода ТСХ - использование в составе подвижных фаз токсичных органических растворителей (метанол, ацетонитрил, четыреххлористый углерод и др.). В качестве элюентов можно применять водные растворы поверхностно-активных веществ (ПАВ), не обладающих токсичными свойствами [4-10].
Выбор объектов анализа объясняется огромным значением витаминов А, Е и группы В для человека. Они участвуют в обменных процессах, протекающих в организме, входят в состав многих ферментов. Дефицит витаминов в организме человека приводит к авитаминозам, болезням желудочно-кишечного тракта, расстройствам сердечно-сосудистой и нервной систем, угнетению роста [11]. Поэтому необходимо контролировать их содержание в биологических объектах, пищевых продуктах и фармацевтических препаратах.
Водорастворимые витамины группы В и жирорастворимые А и Е обладают различными свойствами и строением (рис. 1). Витамины В1 и В12 представляют собой ионные соединения; витамин В6 проявляет гидрофильные, а рибофлавин - гидрофильные и гидрофобные свойства. Жирорастворимые витамины А и Е относятся к гидрофоб-
ным соединениям. Большинство исследований, опубликованных в отечественной и зарубежной литературе, посвящено раздельному определению водо- и жирорастворимых витаминов методом об-ращенно-фазовой ВЭЖХ с флуориметрическим или спектрофотометрическим детектированием [12-23]. При этом возникают определенные проблемы, такие как необходимость определения при различных длинах волн.
Витамины могут находиться в образцах в микро- и макроконцентрациях; некоторые из них представлены в нескольких биоактивных формах, например, витамин В6 может быть в форме пиридоксина, пиридоксаля и пиридоксамина.
Цель данной работы: исследовать возможность совместного определения витаминов А, Е и группы В (В1, В2, В6 и В12) методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии с использованием в составе подвижной фазы мицел-лообразующего реагента - додецилсульфата натрия и количественного денситометрического определения витаминов группы В в фармацевтических препаратах.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Реактивы и материалы. Использовали следующие пластины: "Силуфол" (сорбент Silpearl -широкопористый силикагель по Питри с люми-нисцентным индикатором для УФ 254, алюминиевая подложка); высокоэффективные "Сорбфил" (силикагель СТХ-1А, зернение: 5-17 мкм, толщина слоя 110 мкм, УФ индикатор - 254, алюминиевая и полимерная подложки). Для приготовления подвижных фаз применяли ацетонитрил ^!ика);
B1
N
e
Cl
® /CH3
П
H3C N NH2 S
OH
КАРЦОВА, КОРОЛЕВА B2
R
HO. ^L XH2OH
XT
H3C N
B6
HO HO HO
H-
CH2OH
H H H H
II l" \
O
N JN^O NH
HO H3C
CH
CH3
CH3 CH3
H3C JCH-
CH3 CH3
CH
CH2OH
B12
nh2
I 2
C=O nh2
I I 2
CH2 CH3 C=O
O
H2N—C—CH2 H3C '' H3C
O
H2N—C—
H
O
ch2-ch2-c-nh2
CH3
\^HCH3 O ch2-ch2-c-nh2
CH3
CH3
CH2OH
Рис. 1. Структурные формулы водорастворимых витаминов группы В и жирорастворимых А, Е.
метанол (Merck); хлороформ, бензол, этилацетат, гексан (х.ч.). В качестве мицеллообразующего реагента использовали додецилсульфат натрия (ДДСН).
Объекты анализа: тиамин хлорид (5%-ный водный раствор витамина В1 в ампуле); рибофлавин мононуклеотид (1%-ный водный раствор витамина В2 в ампуле); хлорид пиридоксина (5%-ный водный
Концентрация NHз в п. ф., %
Рис. 2. Зависимость факторов удерживания витаминов группы В от концентрации аммиака в элюенте (неподвижная фаза - силикагель).
Концентрация СН3ОН в п. ф., %
Рис. 3. Зависимость факторов удерживания витаминов группы В от концентрации метанола в элюенте (неподвижная фаза - силикагель).
раствор витамина В6 в ампуле); цианокобаламин (500 мкг витамина В12 в ампуле); пальмитат ретинола (3.44%-ный раствор витамина А в масле); ацетат а-токоферола (10%-ный раствор витамина Е в масле и 50%-ный раствор витамина Е в масле в капсулах). Фармацевтические препараты: таблетки "Аэровит"; таблетки "Компливит".
Аппаратура. Оптический денситометр "Ден-Скан-04" (производство ЗАО "ЛенХром"); УФ-лампа (к = 254 нм); ТСХ-камеры (20 х 20 см); микрошприц МШ-1.
Выполнение анализа. Водные растворы витаминов группы В выпускаются в ампулах. Модельные системы витаминов В1, В2 и В6 готовили разбавлением этих растворов дистиллированной водой (0.25 мл раствора на 1 мл воды). Раствор витамина В12 из ампулы использовали в качестве стандартного, так как разбавление уменьшало чувствительность детектирования. На пластины наносили по 1 мкл стандартных растворов витаминов группы В.
Витамины А и Е в виде сложных эфиров (пальмитата ретинола и ацетата а-токоферола, соответственно) поставляются в форме масляного раствора. Их стандартные растворы готовили экстракцией метанолом. На пластины наносили по 3 мкл полученных растворов.
Пластины подвергали фракционному элюиро-ванию, пропуская вторую водно-мицеллярную подвижную фазу до нижней границы пятна витамина А. Затем пластины извлекали из прояви-тельной камеры, высушивали на воздухе и детектировали в уФ-свете при к = 254 нм.
Модифицирование высокоэффективных пластин "Сорбфил" осуществляли однократным вы-
держиванием их в метанольных растворах ДДСН с концентрациями 0.002; 0.005 и 0.010 моль/л в течение 5 мин.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Анализ водорастворимых витаминов группы В осуществляли в нормально-фазовом режиме ТСХ. на пластинах "Силуфол" и высокоэффективных пластинах "Сорбфил". В ходе эксперимента варьировали состав подвижной фазы. В качестве элюента использовали следующие системы:
а) СН3С1Ч-Н20 (0:1, 1:9, 1:4, 1:2, 1:1, 2:1, 4:1, 9:1, 1:0, по объему);
б) СН30Н-Н20 (0:1, 1:9, 1:4.1:2, 1:1, 2:1, 4:1, 9:1, 1:0, по объему);
в) 1ЧН3-Н20 (0.045; 0.090; 0.180 и 0.270% !ЧН3 в п.ф.).
В случае пластин "Силуфол" из-за низкой эффективности разделения не удалось осуществить разделение витаминов Вь В2, В6 и В12 в одном хро-матографическом цикле. Применение высокоэффективных пластин "Сорбфил" с использованием водного раствора аммиака (0.045%) в качестве подвижной фазы позволило достичь полного разделения этих соединений (рис. 2).
С ростом процентного содержания аммиака в элюенте увеличивается сродство витаминов В6 и В12 к подвижной фазе, и соответствующие значения параметров Rf возрастают. Для витаминов Вх и В2 факторы удерживания с изменением концентрации аммиака не меняются.
При использовании водно-метанольной подвижной фазы отмечено, что увеличение процентного содержания метанола практически не
R
0 20 40 60 80 100 Концентрация CHзCN в п. ф., %
Рис. 4. Зависимость факторов удерживания витаминов группы В от концентрации ацетонитрила в элю-енте (неподвижная фаза - силикагель).
влияет на значения ^ витамина В1 и приводит к незначительному увеличению этого параметра для витамина В6 (рис. 3). Оптимальное содержание метанола в подвижной фазе составило 10%.
Рост концентрации другого органического растворителя в составе водного элюента - ацетонитрила - повышает сродство полярного витамина В6 к силикагелевой неподвижной фазе (рис. 4).
Витамин В12 является самым сложным по структуре витамином. С силанольными и силоксановыми группами силикагеля могут взаимодействовать как карбонильные, так и аминогруппы, входящие в состав его молекул. При использовании в качестве элюента 10%-ного водного раствора метанола или ацетонитрила витамин В12 обладает наибольшим сродством к полярной неподвижной фа-
Таблица 1. Зависимость факторов удерживания витаминов А и Е от состава подвижной фазы
Подвижная фаза Rf
Витамин А Витамин Е
Бензол 0.66 ± 0.03 0.79 ± 0.03
Бензол-этилацетат(20 1) 0.86 ± 0.04 0.91 ± 0.01
Бензол-этилацетат(10 1) 0.87 ± 0.03 0.92 ± 0.01
Хлороформ 0.75 ± 0.01 0.75 ± 0.01
Гексан 0 0
Гексан-этилацетат (20 : 1) 0.48 ± 0.01 0.43 ± 0.06
Гексан-этилацетат (10 : 1) 0.68 ± 0.01 0.68 ± 0.01
Ацетонитрил 0.98 ± 0.01 0.98 ± 0.01
Метанол 0.86 ± 0.01 0.83 ± 0.02
зе по сравнению с витаминами В6 и гидрофобным рибофлавином (рис. 4).
С ростом содержания органического компонента в подвижной фазе увеличивается значение фактора удерживания витамина В12. При использовании 67%-го водного метанола (рис. 3) и 33%-ного водного ацетонитрила (рис. 4) фактор удерживания этого соединения достигает максимального значения.
Таким образом, в нормально-фазовом режиме ТСХ возможно осуществить разделение витаминов В1, В2, В6 и В12, но не удается уменьшить взаимодействие витамина В1 с силанольными гид-роксильными группами сорбента, что существенно при проведении количественного анализа.
Определение жирорастворимых витаминов А и Е осуществляли на высокоэффективных пластинах "Сорбфил". В ходе анализа варьировали состав элюента, используя различные органические растворители. В табл. 1 представлены факторы удерживания витаминов А и Е в зависимости от состава подвижной фазы.
Из приведенных в табл. 1 данных видно, что оптимальным элюентом оказался бензол.
В качестве подвижных фаз, возможно использовать и водные растворы поверхностно-акти
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.