БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2012, том 29, № 6, с. 429-432
УДК 577.25
СОВМЕСТНОЕ УЧАСТИЕ АГОНИСТОВ ЯДЕРНЫХ РЕЦЕПТОРОВ PPAR И ИНГИБИТОРОВ ЦИКЛООКСИГЕНАЗ В РЕГУЛЯЦИИ ПРОЛИФЕРАЦИИ КЛЕТОК ГЛИОМЫ С6 © 2012 г. С. А. Грабеклис, Д. В. Чистяков, Л. Ю. Андреева, М. Г. Сергеева*
Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва, Ленинские горы; *электронная почта: sergeeva@genebee.msu.ru Поступила в редакцию 27.06.2011 г.
Изучено совместное действие агонистов ядерных рецепторов PPAR и ингибиторов циклооксигена-зы (СОХ) на клетки глиомы С6. Показано, что как агонисты PPAR, так и ингибиторы COX подавляют пролиферацию клеток, и эффект зависит от концентрации. Однако совместное применение этих веществ нивелировало их антипролиферативное действие. Это позволяет предположить, что комбинация веществ одного типа действия (в данном случае противовоспалительные лекарственные средства) может приводить к потере их активности на уровне клеточного воспалительного ответа.
Ключевые слова: ядерные рецепторы, астроглиоз, пролиферация, воспаление, циклооксигеназа.
Для нейродегенеративных заболеваний и различных травм головного мозга характерно развитие астроглиоза, или активации воспалительного ответа астроцитов, глиальных клеток мозга, а также их пролиферации. Астроглиоз — это нормальная реакция клеток мозга на действие повреждающего агента, однако избыточная активация клеток ведет к развитию патологий [1], вот почему регуляцию пролиферации астроцитов изучают в различных условиях. Регуляторами могут быть различные низкомолекулярные ингибиторы воспаления, а также агонисты рецепторов, участвующих в процессах разрешения воспаления.
Известно, что многие заболевания ЦНС сопровождаются активацией воспалительного процесса. Современные исследования показывают, что с воспалительным ответом в глиальных клетках мозга связаны ядерные рецепторы PPAR, участвующие в регуляции экспрессии генов, ответственных за формирование воспалительного ответа, а также циклооксигеназы (СОХ), катализирующие образование простагландинов. Повышение экспрессии PPAR и СОХ наблюдается в раковых клетках различного типа, что указывает на вовлеченность пути PPAR/COX в регуляцию жизнедеятельности этих клеток. Более того, путь PPAR/COX на глиальных клетках рассматривают в качестве возможной мишени для терапии нейродегенеративных заболеваний мозга [2]. Ключевым субстратом COX служит арахидоновая кислота, чьи производные, в том числе продукты COX, могут выступать в роли агонистов ядерных рецепторов PPAR [3], т.е. существует еще недостаточно изученная система взаимосвязей между PPAR и СОХ.
В настоящее время известны противовоспалительные свойства агонистов PPAR и ингибиторов СОХ на уровне организма, антипролиферативное действие этих веществ показано также на клетках разного типа. Изучается влияние СОХ и ядерных рецепторов PPAR на развитие опухолей, в том числе глиом. Клеточная линия глиомы С6 активно используется для изучения как процессов опухолевой трансформации, так и различных аспектов биологии астроцитов. Мы предположили, что ингибирование активности СОХ и одновременная активация ядерных рецепторов PPAR их аго-нистами могут улучшить противовоспалительный и антипролиферативный эффект взятых по отдельности веществ. Однако мы нашли лишь одну публикацию, посвященную действию ингибиторов СОХ на активность клеток С6 [4], и не нашли работ, в которых изучали совместное действие агонистов PPAR и ингибиторов COX. Поэтому целью нашей работы стало изучение эффектов совместного применения ингибиторов СОХ и синтетических агонистов PPAR на пролиферацию клеток глиомы С6.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали стрептомицин, пенициллин, эмбриональную телячью сыворотку, глу-тамин, среду DMEM (Панэко, Россия), росигли-тазон, L-165041, GW7647, NS-398, SC-560, ацета-минофен (все Cayman Chem. Comp., ФРГ), CellTiter 96® AQueous One Solution Reagent (Promega).
120
«
и
я
св
р
О
-е
и
ч о
р
С
100
80
60
40
20
PPARa PPARP PPARy - ±
10 20 40 10 20 40 10 20 40 Концентрация, мкМ
Рис. 1. Влияние агонистов РРАЯя (GW7647), РРЛЯр (Ь-165041) и РРАЯу (росиглитазон) на пролиферацию клеток С6. Клетки инкубировали с агонистами РРАК в концентрации 10, 20 и 40 мкМ в течение 48 ч, окрашивали МТ8 в течение 2 ч. Здесь и на рис. 2—5 за 100% принята пролиферация клеток, которые инкубировали в стандартной ростовой среде без добавления лигандов.
Работу проводили на клетках астроцитомы крысы (С6). Клеточную культуру растили в куль-туральных флаконах объемом 75 мл. В один флакон добавляли 10 мл питательной среды ЭМБМ с 10% эмбриональной телячьей сыворотки, глута-мином, а также пенициллином и стрептомицином (100000 ед./мл каждого антибиотика). Клетки культивировали в СО2-инкубаторе (Негаеш ВВЭ 6220, США) при 37°С и 5% СО2. Смену среды и, при необходимости, рассаживание клеток проводили на 3-й день.
За 24 ч до проведения эксперимента клетки рассаживали на 96-луночные планшеты по 20000 клеток в лунку (100 мкл среды с клетками). Через 24 ч
питательную среду заменяли свежей (100 мкл на лунку) с добавлением исследуемых веществ. Через 48 ч оценивали результаты эксперимента.
Число клеток определяли с использованием метода окраски по MTS по стандартному протоколу, предложенному фирмой-производителем Promega, и Celffiter 96® AQueous One Solution Reagent. После обработки клеток действующими веществами в каждую лунку добавляли по 20 мкл MTS, предварительно размороженного на водяной бане (37°С, 10 мин). Далее планшеты инкубировали в течение 2 ч при температуре 37°С в атмосфере с 5% СО2. Затем измеряли оптическую плотность веществ в каждой лунке на спектрофотометре при длине волны 492 нм. В предварительных опытах было установлено, что при использовании данного протокола величины показателей MTS пропорциональны числу клеток в системе.
Каждый опыт проводили в четырех повторно-стях, значения каждой экспериментальной точки в каждом опыте определяли 3 раза.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Как видно из рис. 1, агонист PPARa снижает пролиферацию клеток зависимым от концентрации образом. В использованном диапазоне концентраций агонисты PPARp и PPARy снижали пролиферацию, однако при этом не наблюдалось зависимости эффекта от концентрации агониста. Известно, что высокие концентрации агонистов оказывают неспецифический эффект, не связанный с их действием на PPAR [5], поэтому действие более высоких концентраций мы не анализировали.
С целью определения влияния ингибиторов СОХ на пролиферацию клетки С6 обрабатывали ацетаминофеном, NS-398 и SC-560 в течение 48 ч,
0
100
^ 80
«
и
я
св
р
О
-е
и
ч о
р
С
60
40
20
120
NS-398 SC-560 Acet
of и я
се
р
О
-е
и
ч о
р
С
100
80
60
40
20
0.1 0.5 10.0 Концентрация, мкМ
Рис. 2. Влияние ингибиторов СОХ NS-398 (10 мкМ), SC-560 (1 мкМ), ацетаминофена (Acet, 5 мкМ) на пролиферацию С6 (а), и зависимость эффекта ингибитора СОХ NS-398 от концентрации (б). Клетки инкубировали с ингибитором (0.1, 0.5, 10 мкМ) в течение 48 ч, окрашивали MTS в течение 2 ч.
0
0
СОВМЕСТНОЕ УЧАСТИЕ АГОНИСТОВ ЯДЕРНЫХ РЕЦЕПТОРОВ PPAR
431
120
100
3 80
60
40
20
0
PPARa
PPARß
PPARy
NS-398 PPAR-
агонист
120
100 g 80
я
а л
<D
и
4
о &
П
60
40
PPARa
+ +
++
20
0
SC-560 -PPAR- +
агонист
PPARy
+
++
Рис. 3. Модуляция эффекта агонистов PPAR специфическим ингибитором COX-2 NS-398. Использовали агонисты PPARa (GW7647) - 40 мкМ, PPARß (L-165041) - 40 мкМ и PPARy (росиглитазон) - 40 мкМ; NS-398 — 10 мкМ. Клетки инкубировали в течение 48 ч и окрашивали MTS (2 ч). Пунктирной линией показан уровень пролиферации в присутствии только ингибитора COX-2 в указанной концентрации.
Рис. 4. Модуляция эффекта агонистов PPAR специфическим ингибитором СОХ-1 80-560. Использовали агонисты РРАка (GW7647) - 40 мкМ, РРАЯр (Ь-165041) - 40 мкМ и PPARy (росиглитазон) - 40 мкМ; 8С-560 — 1 мкМ. Клетки инкубировали в течение 48 ч и окрашивали МТ8 (2 ч). Пунктирной линией показан уровень пролиферации в присутствии только ингибитора СОХ-1 в указанной концентрации.
после чего окрашивали MTS (2 ч). На рис. 2а показано как влияют NS-398 (10 мкМ), SC-560 (1 мкМ), ацетаминофен (Acet, 5 мкМ) на пролиферацию клеток С6. Видно, что ингибиторы СОХ, взятые в высоких концентрациях, подавляют пролиферацию клеток С6, и их эффект (около 75% от контроля) сравним с эффектом агонистов PPAR, равным ~80%.
Полученный результат соответствует описанному ранее влиянию ингибиторов СОХ на пролиферацию клеток С6. Однако согласно [4], эффект ацетаминофена (концентрации и длительность воздействия были сопоставимы с использованными нами) был значительно больше (до 10%), а эффект NS-398 — меньше, 80%. Несмотря на количественные различия, эти результаты убедительно показывают, что указанные ингибиторы COX обладают антипролиферативным эффектом.
Можно говорить и о зависимости наблюдаемого эффекта от концентрации действующего вещества на примере NS-398 (рис. 2б). Клетки инкубировали с ингибитором (0.1, 0.5, 10 мкМ) в течение 48 ч и окрашивали MTS. Из рис. 2б видно, что эффект NS-398 зависит от его концентрации и при 10 мкМ составляет 60% от величины в контроле. Повышение эффекта NS-398 при увеличении концентрации наблюдали и ранее [4], однако в этом случае использовали большие концентрации (10 мкМ и выше), чем в настоящей работе.
Предполагается, что механизм антипролифе-ративного действия ингибиторов СОХ связан с остановкой клеточного цикла и, в случае ацета-минофена и NS-398, со стимуляцией апоптоза.
Аналогичным образом изучали совместное действие агонистов PPAR и ингибиторов СОХ. К клеткам добавляли указанные вещества во всех комбинациях агонист PPAR — COX-ингибитор. Всего рассмотрено 9 вариантов (рис. 3—5).
агонист
Рис. 5. Модуляция эффекта агонистов PPAR неспецифическим ингибитором СОХ-1/2 ацетаминофеном. Использовали агонисты PPARa (GW7647) — 40 мкМ, PPARP (Ь-165041) - 40 мкМ и PPARy (росиглитазон) -40 мкМ; ацетаминофен ^се!;) - 5 мкМ. Клетки инкубировали в течение 48 ч и окрашивали МТ8 (2 ч). Пунктирной линией п
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.