УСПЕХИ СОВРЕМЕННОЙ БИОЛОГИИ, 2004, том 124, № 3, с. 234-245
УДК 582.282:575
СОВРЕМЕННЫЕ ДОСТИЖЕНИЯ В ИЗУЧЕНИИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ ПОПУЛЯЦИЙ ФИТОПАТОГЕННЫХ ГРИБОВ
© 2004 г. Н. В. Мироненко
Всероссийский институт защиты растений РАСХН, Пушкин-Санкт-Петербург
Обсуждается использование ДНК-маркеров в исследовании генетической структуры популяций фитопатогенных грибов. Описаны методы молекулярной идентификации видов грибов, основные методологические этапы изучения структуры популяции с использованием современных техник молекулярного фингерпринтинга и конкретные примеры влияния особенностей жизненных циклов на структуру популяций фитопатогенных грибов.
ВВЕДЕНИЕ
Фитопатогенные грибы - обширная группа организмов, относящихся к разным таксонам царства Мус^а и отличающихся особенностями жизненных циклов. Экономическая значимость для сельского хозяйства (например, за 1988-1990 гг. потери урожая основных сельскохозяйственных культур от болезней, вызываемых фитопатоген-ными грибами, только в странах Западной Европы составили 18.7% [82]) обусловила повышенный интерес исследователей к этим грибам. В последние 15 лет изучение структуры популяций фитопатогенных грибов стало основной задачей молекулярно-генетических исследований грибов. Новые знания о структуре и динамике популяций фитопатогенных грибов должны стать основой для разработки новых стратегий создания сортов с длительной устойчивостью.
Современные молекулярные методы исследований популяций грибов используют молекулярные маркеры, неподверженные, в отличие от других маркеров, прямому влиянию естественного отбора. Это позволяет не только подтвердить или уточнить результаты, полученные ранее (с использованием стандартных маркеров вирулентности, агрессивности, вегетативной совместимости, устойчивости к фунгицидам и других), но и получить принципиально новые данные. С изменением методологии исследований меняются наши представления о геноме грибов, механизмах их изменчивости. 20 лет назад молекулярно-генетические исследования фитопатогенных грибов находились в зачаточном состоянии [18]. В качестве механизмов внутрипопуляционной изменчивости асексуальных грибов рассматривали гетерокари-оз, парасексуальный процесс [16] и вегетативную несовместимость [26, 49]. В настоящее время к этим механизмам прибавились мутагенное действие мобильных элементов и возникновение поли-
морфизма по числу и длине хромосом [43]. В по-пуляционных исследованиях фитопатогенных грибов в последние 15-20 лет произошел скачок, связанный с разработкой техник ДНК фингерпринтинга [8, 65, 66, 68, 75, 94], основанных на по-лимеразной цепной реакции (ПЦР).
Данный обзор не претендует на полноту освещения всех направлений популяционных исследований фитопатогенных грибов. В нем рассматриваются проблемы молекулярной идентификации видов грибов, основные методологические этапы изучения структуры популяции и конкретные примеры, демонстрирующие влияние на структуру популяции особенностей жизненных циклов грибов.
ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВИДОВ ФИТОПАТОГЕННЫХ ГРИБОВ
Учитывая еще не изученное в полной мере видовое разнообразие фитопатогенных грибов, наличие видов-двойников, с одной стороны, и существование дивергентных видовых комплексов, с другой, необходимо четко определить принадлежность особей, составляющих конкретную популяцию, к одному биологическому виду.
Идентификация грибов - второй по численности видов группы организмов после насекомых [63, 85] - непростая задача. Грибы вследствие особенностей их жизненных циклов, в том числе чередования полового и бесполого способов размножения с частым превалированием последнего, представляют собой быстро эволюционирующую группу организмов [14, 17, 29, 31, 35, 85]. Большая их часть по-видимому, не обособленные "хорошие" виды, а дивергентные видовые комплексы.
Загрязнение окружающей среды, в том числе широкое употребление различных химических препаратов, может приводить к появлению и/или
отбору генетически измененных грибов с необычными для них свойствами, что также затрудняет их идентификацию.
Молекулярные методы идентификации видов грибов [8, 20, 21, 31] дополняют традиционные микологические методы определения вида, а в ряде случаев представляются единственным способом решения спорных таксономических проблем. Мы использовали для идентификации видов фи-топатогенных и других грибов видоспецифичные пробы ДНК рибосомальных генов (рибДНК) в ДНК-ДНК гибридизации [2, 3, 8] и видоспецифичные праймеры в ПЦР [11].
В 1989 г. нами был предложен метод идентификации видов организмов [4, 10] (в том числе фитопатогенных грибов), основанный на визуальном сравнении спектров ДНК, амплифициро-ванной в ПЦР с универсальными праймерами (УП-ПЦР), и дополненный позднее вариантом ДНК-ДНК гибридизации УП-ПЦР продуктов тестируемых организмов [5, 8, 9, 21, 32].
Метод идентификации видов основан на том, что электрофоретические спектры ДНК, получаемые в результате УП-ПЦР (так называемые УП-ПЦР-паттерны гриба), представляют его мультилокусный гаплотип и видоспецифичны по размеру амплифицированных ДНК фрагментов, а внутривидовая изменчивость выражается в наличии ДНК-полиморфизмов - незначительно измененных спектров амплифицированной ДНК. Видоспецифичность УП-ПЦР-паттернов (их сходство для изолятов, принадлежащих к одному таксономическому виду) обнаружена для грибов Cochliobolus, Pyrenophora, Saccharomyces, Candida, Trichoderma, Aureobasidium, Fusarium и др. [4, 5, 11, 13, 80, 81, 101]. Достоверность метода идентификации видов грибов на основе визуального сравнения УП-ПЦР-паттернов фактически доказана для сахаромицетов с привлечением данных по скрещиванию и выживанию потомства [80, 81], а также для P. teres и C. sativus с использованием дополнительных молекулярных методов диагностики - анализа рестрикционного полиморфизма рибДНК [2, 3] и ПЦР с видоспецифичными праймерами [11]. При сравнении УП-ПЦР-паттернов изолятов одного вида их можно сгруппировать по критерию сходства. Такие группы могут представлять подвиды, специализированные формы, расы и т.д.
Незначительная изменчивость видоспецифич-ных УП-ПЦР-паттернов, наблюдаемая для ряда грибов при использовании отдельных праймеров, объясняется особенностями жизненного цикла гриба (наличием или отсутствием полового процесса и его частотой) и эволюционным статусом вида (консервативным или находящимся в процессе внутривидовой дивергенции).
Путем перекрестной гибридизации УП-ПЦР-продуктов можно изучить их гомологию и разбить организмы на группы с гомологичными (ги-бридизующимися) УП-ПЦР-продуктами. Такие группы организмов, названные генотипическими группами (genetic entities [32]), характеризуются высоким уровнем генетического родства.
Данный подход более универсальный по сравнению с визуальной интерпретацией УП-ПЦР- паттернов. Его необходимо применять в случае, если возникают затруднения в интерпретации сходства УП-ПЦР-паттернов (разные виды или внутривидовая изменчивость). В качестве меченой ДНК-пробы можно использовать отдельные фрагменты УП-ПЦР-паттерна или амплифици-рованную в УП-ПЦР геномную ДНК изолята в целом. На ряде примеров показано, что виды, идентифицированные на основе кросс-гибридизации УП-ПЦР-продуктов, хорошо соответствуют таксономическим видам грибов [11, 12, 13, 38, 59, 81].
Гибридизационная видоспецифичность ПЦР-продуктов, полученных с неспецифичными праймерами, впервые продемонстрированная в [11], показана как для УП-ПЦР- [5, 9, 12], так и для RAPD-продуктов [40, 26, 45, 62]. Установлено также, что видоспецифичные ПЦР-продукты могут представлять собой повторяющуюся ДНК [45, 101]. В ряде случаев наблюдаемая в гибридизации ДНК видоспецифичность ПЦР-продуктов не абсолютна, т.е. отдельные фрагменты показывают гомологию на межвидовом уровне [5, 26, 27, 100]. Это свидетельствует, как правило, о переходном видовом статусе анализируемых грибов, объединяемых в единый видовой комплекс [26, 100]. Например, гибридизационный анализ УП-ПЦР-продуктов показал, что таксономические виды C. sativus, C. carbonum, Drechslera bisepta-ta, C. victoriae, C. heterostrophus и C. cynodontis кросс-гомологичны на уровне генома, т.е. имеют единую структуру генома и, следовательно, представляют собой видовой комплекс [19, 34], что подтвердает выдвинутое еще в 1951 г. предположение, что C. sativus, C. victoriae и другие виды со сходной морфологией конидий, включая C. carbonum, составляют комплекс близкородственых видов [60]. По данным [19], C. sativus является дивергентным компонентом этого видового комплекса. Интересно, что топология дерева, построенного по данным УП-ПЦР анализа, совпала с топологией дерева, построенного по данным полиморфизма рибДНК [19].
Необходимо заметить, что проблема видоспе-цифичной ДНК грибов далека от своего решения. Очевидно, для биологических видов и видовых комплексов такая ДНК существует, хотя закономерности ее эволюции еще не изучены. Для таксономических видов ее "присутствие" зависит от того, какой статус в рамках концепции биологи-
ческого вида имеют сами эти виды (вид или внутривидовая форма).
МЕТОДОЛОГИЯ АНАЛИЗА СТРУКТУРЫ ПОПУЛЯЦИИ ФИТОПАТОГЕННЫХ ГРИБОВ
Современные исследования структуры популяции включают 3 основные этапа: 1) сбор популяции и выделение моноспоровых культур грибов, 2) определение фенотипов изолятов, в том числе молекулярных, 3) статистическая обработка данных и интерпретация результатов.
Сбор популяций фитопатогенных грибов
и выделение моноспоровых культур грибов
Метод сбора популяций зависит от поставленных задач. При сравнительном изучении популяций сборы производят в различных географических зонах с производственных посевов районированных сортов. С целью нивелирования фактора влияния растения-хозяина на структуру популяции сборы следует проводить с одного сорта. При исследовании популяций фитопатогенных грибов вначале собирают пораженные части растений-хозяев, а затем из них в чистую культуру выделяют патоген. Особенности сбора природных популяций фитопатогенных грибов описаны в обзорах [1, 23] на примерах возбудителей пятнистос-тей ячменя Pyrenophora teres, Cochliobolus sativus и ржавчинных грибов.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.