УДК 579.66:57.083.1
СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К СОЗДАНИЮ ПРОМЫШЛЕННЫХ ШТАММОВ МИКРООРГАНИЗМОВ
© 2015 г. В. Г. Дебабов
Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Москва 117545 e-mail: genetika@genetika.ru Поступила в редакцию 13.10.2014 г.
Штаммы-продуценты микроорганизмов являются основой промышленной биотехнологии. Их свойства определяют экономические параметры производства. Для конструирования штаммов микроорганизмов используются методы рационального дизайна (метаболическая инженерия) и комбинаторные методы мутагенеза и отбора (лабораторная эволюция, адаптивная эволюция, белковый и геномный шафлинг). Часто используется комбинация этих методов. Современные штаммы обычно не содержат плазмид и маркеров лекарственной устойчивости. Все изменения вносятся в хромосому методами гомологичной и сайт-специфической рекомбинации. Сумму таких подходов называют рекомбиниринг. Экспрессия генов осуществляется на оптимальном уровне под контролем промоторов определенной силы, часто регулируемых. Знание полной геномной последовательности — почти обязательное условие использования приемов метаболической инженерии. Биоинформатика оказывает существенную помощь в выборе ферментов, поиске нужных генов и метаболических реакций. Измерение метаболических потоков оказывает большую помощь при конструировании штаммов. Современный уровень науки позволяет конструировать в штаммах метаболические пути de novo для производства химикатов и биотоплива. В перспективе сырьем для микробиологической промышленности может стать углекислый газ, поэтому исследование фиксации СО2 ацетогенами и электрогенами — перспективное направление исследований.
DOI: 10.7868/S0016675815040049
Микробиологическая промышленность — получение ценных веществ методом микробиологического синтеза — сегодня является частью быстро развивающейся биотехнологии. Темпы роста этой промышленности обгоняют средние темпы роста других отраслей, что определяется как ростом производства традиционных продуктов, таких как аминокислоты, ферменты, так и развитием новых областей — биотоплива, химикатов, би-оразлагаемых пластиков (таблица).
Параметры штамма-продуцента микроорганизма решающим образом определяют экономику процесса и саму возможность его промышленной реализации. Штаммы-продуценты часто теперь называют микробными клеточными фабриками (MCF — microbial cell factories). Традиционные требования к промышленному штамму — это безопасность, стабильность, высокий выход продукта в расчете на единицу субстрата (г продукта на г субстрата), высокая скорость биосинтеза (г продукта/л/час), высокая конечная концентрация (г/л), отсутствие трудно отделимых примесей.
Современные штаммы имеют впечатляющие характеристики. Так, продуцент L-треонина на базе E. coli имеет конверсию около 53% (г аминокислоты на г глюкозы), скорость биосинтеза около 4.2 г/л/час и конечную концентрацию около
150 г/л. Показатели продуцента Ь-лизина на базе СогупоЬас1вгшт имеют еще более высокие характеристики.
Если производство традиционных продуктов, таких как аминокислоты, ферменты, антибиотики, возможно на таком сырье как сахароза и глюкоза, получаемая из гидролизатов крахмала, т.е. на пищевом сырье, то будущее производство биотоплива и химикатов, которые к 2020 г. должны измеряться десятками и сотнями миллионов тонн, требует перехода на другое (не пищевое) сырье. На ближайшую перспективу таким сырьем является лигноцеллюлоза, т.е. древесина, солома и другие сельскохозяйственные отходы. Актуальная задача исследователей сегодня — создание штаммов, способных эффективно усваивать сахара гидролизатов лигноцеллюлозы. Наиболее универсальным путем переработки лигноцеллюлозы является ее газификация с получением синтез-газа, т.е. смеси СО, СО2 и Н2. Микроорганизмы, в принципе, могут использовать синтез-газ как единственный источник углерода и энергии [1, 2]. Создание продуцентов, использующих это сырье, является важным вызовом для современной науки.
Возможно, в более отдаленной перспективе важным станет освоение электробиосинтеза с ис-
443
4*
Мировое производство микробиологической продукции (2013 г.)
№ п.п. Продукт Продуценты Количество продукта, тыс. тонн в год
1 Топливный этанол Saccharomyces cerevisiae 100000
2 Глутамат натрия Corynobacterium 3000
3 Ь-Лизин Corynobacterium 2100
4 Ь-Треонин Escherichia coli 400
5 Ь-Лимонная кислота Aspergillus 2000
6 Ь-Молочная кислота Lactobacillus 400
7 Бутан о л Clostridia около 100
8 1,3-Пропандиол Escherichia coli 70
9 Итаконовая кислота Aspergillus thereus 70
10 Янтарная кислота Escherichia coli, дрожжи 60
11 Ферменты*
* На сумму около 4.5 млрд $ США.
пользованием электрогенных микроорганизмов, способных осуществлять биосинтез на основе СО2 и электрического тока [3]. В связи с развитием индустрии биотоплива и химикатов возникает задача организации биосинтеза веществ, которые ранее микроорганизмами не синтезировались, т.е. задача организации новых биохимических путей в микробной клетке.
Все методы создания штаммов можно разделить на две группы. Это рациональный дизайн, часто называемый метаболической инженерией, который подразумевает целенаправленную реорганизацию геномов. Метаболическая инженерия возможна при наличии знаний о метаболических путях биосинтеза нужного вещества, о регуляции этого пути и сопряженных с ним реакций в метаболической сети.
Вторая группа методов, которую можно назвать комбинаторной, основана на введении множественных генетических изменений (мутаций) в геном и отборе из созданного разнообразия нужных вариантов. Метод очень трудоемок, но он не связан с наличием знаний о путях биосинтеза. Анализ отобранных продуктивных штаммов дает новые знания о генах, вовлеченных в сверхсинтез нужного вещества. К комбинаторным методам относятся классическая селекция, направленный мутагенез, часто называемый направленной лабораторной эволюцией, адаптивная лабораторная эволюция, шафлинг генов и геномов, т.е. объединение мутаций методами рекомбинации.
Начало систематических работ по созданию штаммов-продуцентов было положено в конце 40-х годов прошлого века в процессе становления и развития антибиотической промышленности. В то время отсутствовали знания о биохимических путях синтеза антибиотиков и не были разработа-
ны методы генетического обмена. Основным подходом к созданию продуцентов был метод индуцированного мутагенеза и отбора наиболее продуктивных вариантов. В русской литературе метод получил название "ступенчатого отбора", а в иностранной — "классической селекции" (classical selection — CS или classical strain improvement — CSI). Метод чрезвычайно трудоемок, но, тем не менее, с помощью этого метода созданы почти все промышленные штаммы антибиотиков, многих ферментов и аминокислот. Отечественные ученые внесли большой вклад в развитие этого метода, особенно школа С.И. Алиханяна [4, 5].
С развитием методов генетического обмена, особенно с появлением методологии генетической инженерии, все большее значение приобретает метаболическая инженерия. Тем не менее при создании промышленных штаммов используются, как правило, оба подхода: и комбинаторные методы, и рациональный дизайн с постепенным увеличением доли последнего [4—7].
КОМБИНАТОРНЫЕ МЕТОДЫ
Классическая селекция, геномный шафлинг. Эффективность классической селекции зависит от возможностей экспериментатора создать генетическое разнообразие (т.е. от эффективности мутагенеза) и от способности найти нужный фенотип среди огромного числа вариантов (т.е. от эффективности скрининга). Часто нужный генотип (способность производить целевое вещество) не имеет выраженного фенотипа. В этом случае приходится анализировать продуктивность штаммов, полученных из отдельных колоний специальными тестами, и в одном опыте трудно проанализировать более 103 колоний. Такого сорта отбор часто занимает многие годы.
Осложнением ступенчатого отбора является накопление "вредных мутаций" в штамме-продуценте, что часто выражается в ауксотрофности, снижении скорости роста. Рекомбинация между штаммами, получившая название "геномный шафлинг" (шафлинг — тасовка карт), может резко ускорить процесс классической селекции штаммов, собирая в штамме "хорошие" мутации и убирая "плохие" [8]. Методом геномного шафлинга были созданы, например, продуцент антибиотика тилозина [9] и штамм дрожжей, усваивающих ксилозу и синтезирующих этанол с повышенной скоростью. В последнем случае осуществлялся шафлинг между геномами дрожжей разных видов — S. cerevisiae и P. stipis [10].
Отбор облегчается, если целевой штамм имеет видимый фенотип, например штаммы-продуценты каротиноидов окрашены и до некоторой степени окраска пропорциональна концентрации каротиноидов [11]. В таких случаях методом колориметрии колоний на чашках и используя планшеты и робототехнику удается достаточно легко скринировать библиотеки размером 106 клеток [12].
Наиболее эффективным методом отбора на сегодня являются клеточные сортеры, которые могут измерять флуоресценцию метаболитов в индивидуальных клетках. Метод называется проточной цитометрией, или FACS (fluorescence-activated cell sorting). С помощью таких сортеров можно рутинно скринировать библиотеку в 109 клеток [13, 14]. Правда, для этого метаболит должен обладать собственной флуоресценцией. Метод широко использован при скрининге в процессе селекции продуцентов каротиноидов [15], липидов [16], полигидроксиалконатов [17]. Интересное приложение метода — это оценка внутриклеточного рН. Для этих целей используется краситель, меняющий спектр флуоресценции в зависимости от рН. Используя мутагенез и отбор с помощью сортера, удалось отобрать клетки дрожжей с измененным внутриклеточным рН и повышенной способностью к синтезу лактата [18]. Расширением метода FACS является конструирование сенсоров, регистрирующих нефлуоресци-рующие метаболиты. Часто в таких сенсорах используют транскрипционные факторы. Например, концентрацию лизина в единичной клетке можно регистрировать в штамме, где желтый флуоресцирующий белок кодируется геном с промотором lysE (экспортер лизина из клетки), которы
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.