МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2004, том 38, № 2, с. 250-255
== ГЕНОМИКА. ТРАНСКРИПТОМИКА. ПРОТЕОМИКА
УДК 577.21:595.773.4
Ускоренная публикация
СОЗДАНИЕ НОВОЙ КОНСТРУКЦИИ ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ ДНК И МОДЕЛИРОВАНИЯ СТРУКТУР ПОЛИТЕННЫХ ХРОМОСОМ ДРОЗОФИЛЫ
© 2004 г. П. И. Зимин, А. А. Горчаков, С. А. Демаков*, И. Ф. Жимулев
Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск, 630090
Поступила в редакцию 01.10.2003 г.
В результате модификации вектора трансформации pCaSpeR3 на основе Р-элемента получена новая конструкция pICon. Она содержит структурную часть гена lacZE. coli с "подшитыми" к ней 5'- и 3'-регуляторными участками гена hsp70, плазмиду pUC19 и два тандемно расположенных FRT-сай-та. Наличие промотора гена hsp70 позволяет при индукции тепловым шоком (ТШ) определить район инсерции на политенных хромосомах на уровне светового и электронного микроскопов. Последовательность плазмиды pUC19 с полилинкером может быть использована для клонирования прилежащей к З'-концу транспозона области генома с помощью метода "спасения Р-мишени". Наличие FRT-сайтов позволяет вырезать и встраивать по ним различные фрагменты ДНК. Транспозон имеет большой размер (22046 п.н.) и формирует в составе политенных хромосом легко выявляемые структуры. В целом, конструкция может быть использована для решения различных задач по изучению закономерностей структурно-функциональной организации генома дрозофилы, в частности для выяснения причин формирования дискового рисунка политенных хромосом. Для картирования молекулярных границ междиска 3С6/С7 в вектор pICon встроена последовательность ДНК из этого района между FRT-сайтами.
Ключевые слова: Drosophila melanogaster, Р-транспозон, FLP/FRT-рекомбинация, политенные хромосомы.
Молекулярно-генетические конструкции на основе Р-элементов широко используются для изучения структурной и функциональной организации политенных хромосом, в частности для изучения причин формирования диск-междискового рисунка. Ранее показано, что Р-транспозоны в составе политенных хромосом часто выявляются как новые диски [1-4]. Это возможно только в том случае, если встройка произошла в междиск либо в пограничный участок между диском и междиском. Поскольку молекулярно-генетичес-кие характеристики транспозонов известны, можно получить клоны ДНК из районов междисков, определить их нуклеотидную последовательность и затем выяснить возможные генетические свойства этих районов [2, 5, 6]. Однако такой подход не позволяет определить точные молекулярные границы междисков, что, в свою очередь, затрудняет выяснение причин декомпактного состояния этих структур. Для определения последовательностей ДНК, необходимых и достаточных для формирования междисков, нами был предложен подход с использованием РЬР/РЯТ системы 2\ плазмиды дрожжей [7]. ЕЬР-рекомбиназа осуществляет сайт-
* Эл. почта: demakova@bionet.nsc.ru
специфическую рекомбинацию по РЯТ-сайтам. При этом в результате рекомбинации по однонаправленным РЯТ-сайтам расположенные между ними последовательности (вместе с одним сайтом БЯТ) удаляются и формируется кольцевая молекула ДНК [8]. Показана также возможность встраивания кольцевой ДНК, содержащей РЯТ-сайт, по БЯТ-сайту мишени [9, 10]. Эти свойства позволяют встраивать в одно и то же генетическое окружение как нативные, так и модифицированные последовательности ДНК.
В данной работе мы получили Р-транспозон р1Соп, свойства которого позволяют легко идентифицировать сайты его инсерции в хромосомы с помощью световой и электронной микроскопии, клонировать прилежащую к З'-концу транспозона последовательность генома методом "спасения Р-мишени" по восьми сайтам рестрикции, а также встраивать и удалять из него в составе генома дрозофилы по РЯТ-сайтам различные последовательности ДНК.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
Все основные процедуры, связанные с выделением и обработкой ДНК, выполняли, как описано ранее [11].
Секвенирование и компьютерный анализ ДНК.
Для секвенирования ДНК клонов, полученных методом "спасения Р-мишени", использовали набор ABI PRISM® BigDye Terminator v3.0 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit. Реакцию секвенирования проводили с использованием праймера P2827 (5 '-TCCTTTCACTCGCACTT-3'), комплементарного З'-концу Р-элемента. Нуклеотидные последовательности анализировали, используя программное обеспечение BLAST [12] и данные Fly-Base [13].
Ведение линий и трансформация генома дрозофилы. Линии мух вели на стандартном корме массово, без отбора, при 25 °С. Описание генов, мутаций и балансерных хромосом дрозофилы приведено в базе данных FlyBase [13]. Трансформацию генома дрозофилы проводили по стандартному протоколу [14]. ДНК транспозона p3C-ICon инъецировали в эмбрионы генотипа y1,Df(1)w67c23; A2-3,Ki,pP, после чего трансгенных мух с окрашенными глазами отбирали в первом поколении и скрещивали с мухами генотипа y1,w-; CyO/If; MKRS/TM6B. Сибсов фенотипа CySb- с окрашенными глазами скрещивали между собой и выводили гомозиготные по инсерции линии. Для дальнейшего анализа использовали 3 линии мух, несущие уникальные жизнеспособные в гомо/гемизиготе инсерции p3C-ICon.
Приготовление давленых препаратов поли-тенных хромосом и флуоресцентная гибридизация in situ (FISH). Давленые препараты политен-ных хромосом для гибридизации in situ готовили по методу Голла и Пардью [15]. Чтобы индуцировать пуфы теплового шока (ТШ) железы перед фиксацией инкубировали при температуре 37°С в течение 15 мин. ДНК плазмиды Carnegie-20 [14], которая содержит ген rosy, концы Р-элемента, плазмиду pUC8 и фрагменты ДНК из локуса white, метили с помощью DIG-11-dUTP фирмы "Roche" (Швейцария). Реакцию включения меченого предшественника проводили методом статистической рассеянной затравки по протоколу фирмы "Roche" (Швейцария). Для метода FISH использовали протокол, описанный ранее [5].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Создание конструкций pICon и p3C-ICon
ДНК плазмиды c4yellowhs2 [16], содержащую 5'- и 3'-регуляторные области гена hsp70, гидро-лизовали рестриктазой SacI, 3'-выступающие концы затупляли фрагментом Кленова, затем ДНК гидролизовали рестриктазой BamHI. Фрагмент BamHI-SacIT размером 900 п.н. встраивали по сайтам BamHI и XbaIT в модифицированную (без фрагмента XhoI-SalI) плазмиду pBluescript KSII [17] с образованием плазмиды hsp-pBlue* (рис. 1а). Фрагмент SalI-SalI из плазмиды pCaSpeR-
AUG-betaGal [18], содержащий кодирующую область гена lacZ E. coli, подстраивали к 5'-регуля-торной области гена hsp70 плазмиды hsp-pBlue* по сайтам Xhol-Sall с образованием плазмиды hsp-lacZ-pBlue* (рис. 16). Фрагмент ДНК с двумя тан-демно расположенными FRT-сайтами вырезали по сайтам KpnI и XmaI из модифицированной плазмиды J33R [19], из которой ранее был удален фрагмент SalI-BamHI размером 2.3 т.п.н., и встраивали по этим же сайтам в плазмиду hsp-lacZ-pBlue* c образованием плазмиды FRT-hsp-lacZ (рис. 1в). Конструкцию pCaSpeR-FRT-hsp-lacZ-pUC (рис. 1г) синтезировали следующим образом. ДНК модифицированного вектора трансформации дрозофилы pCaSpeR3 [20] с удаленным фрагментом BamHI-PstI гидролизовали рестриктазами NotI и EcoRI и лигировали с фрагментом KpnI-NotI из плазмиды FRT-hsp-lacZ, содержащим FRT-сай-ты, ген lacZ с "подшитыми" к нему 3'- и 5'-регуля-торными областями гена hsp70 и с плазмидой pUC19 [21], гидролизованной рестриктазами KpnI и EcoRI. HindIII-HindIII-фрагмент ДНК размером 7.2 т.п.н. из плазмиды Carnegie-20, содержащий ген rosy [14], встраивали в плазмиду pBluescript KSII по сайту HindIII с образованием плазмиды ry-pBlue (рис. 1д), которую затем гидролизовали рестриктазами NotI и Acc65I, 5'-выступающие концы затупляли и встраивали в плазмиду pCaSpeR-FRT-hsp-lacZ-pUC по сайту Acc65IT с образованием вектора для трансформации дрозофилы pICon (GenBank acc. no AY336796) (рис. 1e).
Вектор p3C-ICon синтезировали следующим образом. Фрагмент ДНК размером 1.5 т.п.н. из района 3С6/С7 Х-хромосомы (координаты 192129-193632 контига AE003426 из аннотированного генома дрозофилы) [13] амплифицировали с использованием праймеров, в которые были введены сайты узнавания для рестриктазы NheI: swb6-1Nhe - 5'-
GCTGT GCTAGCNheI TCTGTG ACCC- 3' и swb1-2Nhe - 5 '-GGA GCTAGCNheITTGGCAGCGCGC-3'. Полученный продукт гидролизовали рестриктазой NheI и встраивали по сайту NheI в pICon между FRT-сайтами (рис. 1ж).
Проверка функционирования элементов конструкции p3C-ICon в составе генома дрозофилы
Поскольку конструкция pICon содержит неактивные в слюнных железах гены, которые, как было показано ранее, формируют в составе поли-тенных хромосом диски [2, 5, 6], то при встраивании различных фрагментов ДНК по FRT-сайтам можно изучать способность таких фрагментов формировать междиск в другом, заданном генетическом окружении.
Для планируемых опытов по моделированию "искусственных" междисков мы поместили ДНК
252
ЗИМИН и др.
B XhS Sc K [Xh/S] Xm B X Sc
JtAjt + u_I * * I
c4yellowhs2 (9712)
1
pBlue* (2955)
K Xh H B X Sc
pBluescript KSll (2961)
K [Xh/S]B XhS [Sc/X] Sc S
LUt^BÜ +
1
Carnegie-20 (15087)
hsp-pBlue* (3865)
K [Xh/S] Xm[Xh/S]
pCaSpeR-AUG-betaGal (12130)
Ac Xh H H B X N
LLL
W
hsp-lacX-pBlue* (8175)
K Xm[Xh/S]
I
S
+ JyJ
I
ry-pBlue (10233)
e
pCaSpeR-FRT-hs-lacZ-pUC
J33R[S/B] (2836)
ы±
SN K
I
FRT-hsp-lacZ
(8300)
*\jjL + + +
pUC19 (2686)
NRI
►С =^4
C, Xh, A, B, X, S, P, Sp
plCon (23245)
I
pCaSpeR3* (7805)
pCaSpeR-FRT-hs-lacZ-pUC (15881)
Rl swb6-1Nhe swb1-2Nhe Rl Mil III INI ................^......"min III III lllllll^
3CRpBlue (7763)
C, Xh, A, B, X, S, P, Sp
p3C-ICon (24803) (22046)
1 Т.П.Н.
I_I
5'- и 3'-регулярные 1 acZ области гена hsp70
i white ^ ^ концы P-элементы
I вспомогательные последовательности ДНК
фрагмент ДНК из района междиска 3С6/С7
плазмида pUC19
Рис. 1. Схема получения конструкций р1Соп и р3С-1Соп. Сайты рестрикции: А - Лра1;, Ас - Лсс651; В - BamHI; С - СЫ; Н - ЯгиdIII; К - N - Шй; Р - ЛЙ; Ы - ЕгоМ; 8 - ЗОЛ; 8с - SacI; 8р - БрМ; X - Xbal; ХИ - XhoI; Хт - XmaI. swb6 -1№е и swb1 - 2№е - праймеры, использованные для получения фрагмента ДНК междиска 3С6/С7. В скобках указаны размеры кажд
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.