ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 51, № 4, с. 402-411
УДК 577.15,663.15,663.81,664.121
СОЗДАНИЕ ПРОДУЦЕНТОВ ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКИХ И ПЕКТОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ НА ОСНОВЕ ГРИБА Pénicillium verruculosum
© 2015 г. Е. В. Бушина*, Е. А. Рубцова*, А. М. Рожкова*, О. А. Синицына**, А. В. Кошелев***, В. Ю. Матыс***, В. А. Немашкалов***, А. П. Синицын* **
* Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, Москва, 119071 e-mail: inbi@inbi.ras.ru
**Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, химический факультет, Москва, 119991 ***Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино Московской обл. 142290
e-mail: rta@ibpm.pushchino.ru Поступила в редакцию 15.01.2015 г.
На основе гриба Pénicillium verruculosum созданы штаммы, комплекс внеклеточных ферментов которых содержит как целлюлолитические ферменты этого гриба, так и гетерологичные пектинлиазу А из P. canescens и эндо-1,4-а-полигалактуроназу из Aspergillus niger. Активность эндо-полигалактуро-назы ферментных препаратов, полученных из культуральной жидкости штаммов-продуцентов, достигала 46—53 ед./мг белка, а пектинлиазы — 1.3—2.3 ед./мг. Оптимумы температуры и рН рекомби-нантных пектинлиазы и эндо-полигалактуроназы соответствовали описанным в литературе для этих ферментов. Содержание гетерологичной эндо-полигалактуроназы в исследованных ферментных препаратах составило 4—5% от общего белка, пектинлиазы — 23%. Выход восстанавливающих сахаров при гидролизе отходов переработки сахарной свеклы и яблок наиболее эффективным ферментным препаратом составил 41 и 71 г/л, что соответствовало степени конверсии полисахаридов 49 и 65%. Основным продуктом гидролиза отходов переработки сахарной свеклы и яблок была глюкоза.
Ключевые слова: пектиновые вещества, пектинлиаза А, эндо-1,4^-полигалактуроназа, Penicillium verruculosum.
DOI: 10.7868/S0555109915040042
Препараты ферментов могут использоваться при получении различных продуктов из растительного сырья. Из растительных материалов с высоким содержанием пектиновых веществ производят сахар, вина, соки, пюре, ягодные морсы и др. Применение ферментов, способных эффективно гидролизовать пектин и целлюлозу, позволяет увеличить выход целевых продуктов, способствует повышению их качества и улучшению их органо-лептических показателей.
Ферментативный гидролиз используется при получении из растительного сырья С6, С5 сахаров, которые, в свою очередь, служат основой для производства топлива (спиртов [1]), исходных веществ для получения полимеров (изопрена, органических кислот [2]), кормовых добавок (ветеринарных антибиотиков [3], аминокислот, кормовых дрожжей [4], ферментных препаратов [5, 6] и др.).
Известно, что полисахариды составляют от 30 до 90% сухих веществ растительной клеточной стенки [7] и подразделяются на три класса: целлюлоза, гемицеллюлозы (или связующие глика-ны) и пектиновые вещества. Последние содер-
жатся во внешних слоях клеточной стенки и при проведении ферментативной конверсии растительного сырья с высоким содержанием пектинов затрудняют доступ ферментов к целлюлозе и гемицеллюлозам. Поэтому при проведении ферментативного гидролиза растительных материалов с высоким содержанием пектиновых веществ необходимо присутствие различных пектолити-ческих ферментов.
Коммерческие ферментные препараты (ФП), используемые для обработки пектин- и целлюло-зосодержащих материалов, можно разделить на две группы [8]. К первой группе принадлежат ФП с высоким содержанием пектолитических ферментов, которые используются при производстве пищевых продуктов и обладают относительно невысокой гидролитической активностью по отношению к целлюлозе и гемицеллюлозам. Ко второй группе можно отнести ФП целлюлаз, которые применяются для гидролиза целлюлозосодержа-щих материалов и содержат как пектиназы, так и целлюлазы. Такие ФП отсутствуют на рынке.
Ранее было показано, что мутантный штамм гриба Pénicillium verruculosum секретирует комплекс целлюлаз, способных эффективно гидролизовать целлюлозу [9]. В состав целлюлолитеского комплекса этого гриба входят основные ферменты, участвующие в гидролизе целлюлозы — целлобио-гидролазы (ЦБГ, КФ 3.2.1.91) и эндо-1,4-Р-глюка-назы (ЭГ, КФ 3.2.1.4). Однако в составе комплекса секретируемых ферментов гриба P. verruculosum отсутствуют пектолитические ферменты.
Цель работы — получение на основе целлюло-литического штамма P. verruculosum продуцентов, способных секретировать пектиназы — пектин-лиазы (ПЕЛ, КФ 4.2.2.10), эндо-1,4-а-поли-галактуроназы (ПГ, КФ 3.2.1.15) и целлюлазы, изучение свойств полученных ФП, в том числе гидролиза ими природных пектин- и целлюлозо-содержащих субстратов.
МЕТОДИКА
Реагенты. Для приготовления полиакриламид-ных гелей и буферных систем использовали реагенты фирм "BioRad" (США), "MP Biomedicals Inc." (Франция), и "Реахим" (Россия), также кумасси бриллиантовый синий R-250 фирмы "Ferak" (Германия). В качестве белков-маркеров (10—200 кДа) при определении молекулярной массы использовали набор MW-SDS 200 ("Fermentas", (Литва).
Субстраты. КМЦ (Na-соль), я-нитрофенил-Р-D-глюкопиранозид (пНФГ), полигалактуроновая кислота (ПГК, K-соль), пектин цитрусовый со степенью этерификации более 70%, березовый кси-
лан получены из фирмы "Sigma" (США), целлоби-оза — "Merck" (Германия), ß-глюкан ячменя — "Megazyme" (Ирландия), микрокристаллическая целлюлоза (МКЦ, "МКЦ Центр", Россия). МКЦ измельчали на лабораторной планетарной шаровой мельнице АГО-2 (ЗАО "Новиц", Россия).
Высушенные гранулированные отходы переработки сахарной свеклы (свекловичный жом, СЖ) измельчали до частиц размером 0.5—1 мм в ножевой мельнице MF10 basic "IKA Werke" (Германия). Нерастворимые в воде отходы после получения яблочного сока (яблочный жом, ЯЖ) высушивали и также измельчали в мельнице MF10 basic.
Штаммы микроорганизмов. Для трансформации плазмидами использовали рекомбинантный штамм P. verruculosum BI-537 niaD(-) с дефектом в гене niaD, кодирующем нитратредуктазу. Для субклонирования целевых генов, а также для препаративного получения ДНК использовали E. coli штамм Mach-1 (ArecA1398 endAl tonA Ф80А^М15
AlacX74 hsdR(rK m K) фирмы "Invitrogen" (США).
Плазмиды. В составе использованных в работе экспрессионных плазмид pPel и pPG целевые гены гетерологичных ПЕЛ А из Р. canescens (pelÄ) и ПГ из A. niger (pga) находились под контролем гомологичного промотора гена ЦБГ I P. verruculosum (cbhl). Плазмида pPG была получена по схеме, включающей амплификацию гена pga методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) из геномной ДНК штамма A. niger с применением олигонуклеотидов:
pG-UIC: gacgctggtgaaagtaacacagatgctgaagatcagttgagttg, pG-LIC: agagcaagccgagcaggtctaactacaacacccaacgacaccttcc,
и клонирования полученного ПЦР-продукта в вектор pUC-CBH, обеспечивающий экспрессию целевого гена pga за счет его стабильной интегра-тивной встройки в хромосому гриба P. verruculosum. Клонирование гена pga проводили с использованием метода независимого лигирования, описанного в работе [10]. Стандартные процедуры выделения геномной ДНК, ПЦР-продуктов из агарозного геля, а также плазмидной ДНК осуществляли с помощью наборов фирмы "QIAGEN" (США), руководствуясь методиками производителя. ПЦР проводили на приборе MyCycler ("BioRad", США) по следующей схеме: 95°С — 3 мин —
1 цикл; 95°С - 1 мин 20 с, 57°С - 1 мин, 68°С -
2 мин 30 с — 20 циклов; 68°С — 10 мин, 4°С — 25 мин.
Культивирование штаммов P. verruculosum. Штаммы выращивали в колбах емкостью 750 со 100 мл среды следующего состава (%): KH2PO4 — 1.5, (NH4)2SO4 • 7H2O - 0.5, MgSO4 • 7H2O - 0.03, CaCl2 - 0.03, глюкоза - 1.0, дрожжевой экстракт - 1.0,
МКЦ — 4.0 и пшеничные отруби — 1.0. После культивирования в течение 144 ч культуральную жидкость (КЖ) отделяли от мицелия центрифугированием в течение 10 мин при 10750 g.
Получение ФП. Штаммы-продуценты культивировали в течение 144—168 ч в ферментерах (1 л) на среде приведеного выше для культивирования в колбах состава. Ферментации проводили в ИБФМ РАН (Пущино). После отделения биомассы гриба-продуцента КЖ исходного штамма Р. уегтиси-losum В1-537 и других рекомбинантных штаммов лиофильно высушивали.
Определение активности ферментов в ФП. Активность по отношению к субстратам (карбокси-метилцеллюлоза, КМЦ; Р-глюкан, полигалактуроновая кислота, ПГК; ксилан, КСИЛ; микрокристаллическая целлюлоза, МКЦ) оценивали по начальным скоростям образования восстанавливающих сахаров (ВС). ВС определяли методом Шомоди—Нельсона, согласно методике [11], а
также бицинхонинатным методом [12]. За единицу активности принимали такое количество фермента, которое приводит к образованию 1 мкмоль ВС за 1 мин при рН 5.0, 50°C при концентрации субстрата 5 г/л.
ß-Глюкозидазную активность определяли по скорости образования «-нитрофенола при гидролизе пНФГ. За единицу активности принимали количество фермента, необходимое для образования 1 мкмоль «-нитрофенола за 1 мин при рН 5.0 и 40°C [11, 13].
Пектинлиазную активность определяли методом, основанным на измерении начальной скорости накопления Д-4,5-ненасыщенных продуктов деструкции цитрусового пектина [14]. В термоста-тируемую (при 40°C) кювету спектрофотометра, содержащую 2.9 мл раствора субстрата (0.25%) в 0.05 М Na-ацетатном буфере, pH 5.0, вносили 0.1мл раствора ФП и регистрировали кинетику накопления ненасыщенных продуктов реакции при 232 нм. За единицу активности принимали такое количество фермента, которое необходимо для образования 1 мкмоля продукта за 1 мин. Количество Д-4,5-ненасыщенных продуктов деградации пектина рассчитывали, используя коэффициент молярного поглощения пектина, равный 5500 М-1см-1.
Концентрацию белка определяли методом Лоури [15], используя бычий сывороточный альбумин в качестве стандарта, а также по оптической плотности при 280 нм.
Электрофорез в ПААГ. Разделение белков проводили в 12%-ном ПААГ при pH 8.3 (25 мМ трис-глициновый буфер с Na-ДДС, 1 мг/мл) в ячейке для электрофореза Mini Protein Cell system ("BioRad", США). Гель окрашивали кумасси бриллиантовым синим R-250. В качестве белков-маркеров для определения молекулярной массы использовали набор MW-SDS 200 (10-200 кД
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.