ш
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2013, том 39, № 1, с. 87-98
УДК 577.113.6:546.824-31
СОЗДАНИЕ TiO2~DNA-НАНОКОМПОЗИТОВ, СПОСОБНЫХ ПРОНИКАТЬ В КЛЕТКИ
© 2013 г. А. С. Левина*, ***, З. Р. Исмагилов**, ***, М. Н. Репкова*, ***, Н. В. Шикина*****, С И. Байбородин****, Н. В. Шацкая*, ***, С. Н. Загребельный***, В. Ф. Зарытова*, ***#
*Институт химической биологии и фундаментальной медицины, СО РАН, пр. Лаврентьева 8,
Новосибирск 630090, Россия **Институт катализа СО РАН, Новосибирск ***Новосибирский государственный университет, Новосибирск ****Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск Поступила в редакцию 07.02.2012 г. Принята к печати 21.03.2012 г.
Разработаны методы нековалентной иммобилизации БМА-фрагментов на наночастицах диоксида титана (ТЮ2) с целью получения нанокомпозитов ТЮ2~ВМЛ, способных проникать через клеточные мембраны. Усовершенствован метод получения ТЮ2-наночастиц в аморфной и кристаллической (анатаз, брукит) формах. Частицы охарактеризованы методами рентгенофазового анализа, малоуглового рентгеновского рассеяния, ИК-спектроскопии и атомно-силовой микроскопии. Представлены три способа получения нанокомпозитов: 1) сорбция полилизинсодержащих олигонуклеотидов на наночастицах, 2) сорбция олигонуклеотидов на наночастицах, предварительно модифицированных полилизином и 3) сорбция олигонуклеотидов на наночастицах в присутствии цетавлона. Все способы обеспечивают эффективную и достаточно прочную фиксацию БМЛ-фрагментов на наночастицах и позволяют получать нанокомпозиты с емкостью по олигонуклеотиду до 40 нмоль/мг. Показано, что БМЛ-фрагменты, иммобилизованные на наночастицах, сохраняют способность к комплементарным взаимодействиям. Методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии показано, что БМЛ-фрагменты, иммобилизованные на наночастицах любым из рассмотренных методов, в составе нанокомпозитов могут быть доставлены в клетки без использования трансфекционных агентов и физических методов воздействия.
Ключевые слова: наночастицы, нанокомпозиты, DNA-фрагменты, иммобилизация, проникновение в клетки.
DOI: 10.7868/S0132342313010065
ВВЕДЕНИЕ
Синтетические нуклеиновые кислоты (антисмысловые олигонуклеотиды, рибозимы, дез-оксирибозимы, малые интерферирующие РНК) показали себя перспективными препаратами для воздействия на генетический аппарат клеток, но они пока не нашли широкого применения в тера-
Сокращения: Amf, Anz, Brt — наночастицы диоксида титана в аморфной и кристаллической (анатаз, брукит) форме, соответственно; ctab — цетилтриметиламмонийбромид (цетав-лон); DAPI — 4,6-диамидино-2-фенилиндол; Flu — остаток флуоресцеина; PA — полиамин; 1х PBS — буфер, содержащий 0.14 М NaCl и 0.01 М К-фосфат, рН 7.4; PEI - полиэти-ленимин; PL — поли-Х-лизин; Sp — спермин; Sd — сперми-дин; GE — глицидилизопропиловый эфир; РФА — рентгено-фазовый анализ; АСМ — атомно-силовая микроскопия; МУРР — малоугловое рентгеновское рассеяние; префикс d в обозначении олигодезоксинуклеотидов опущен. #Автор для переписки: (тел. (383)3536124, эл. почта: zarytova@niboch.nsc.ru).
пии, поскольку до сих пор не решена проблема их эффективной доставки в клетки.
Известно, что олигонуклеотиды сами по себе обладают весьма низкой эффективностью проникновения, в первую очередь, из-за отрицательно заряженного углеводо-фосфатного остова, и гидрофобного характера клеточной мембраны. Для доставки олигонуклеотидов в клетки используют трансфекционные агенты, включение в ли-посомы, конъюгирование с полимерами различной природы, электропорацию и др. Наиболее полно эти методы описаны в обзорах [1, 2]. В последнее время для решения проблемы доставки в клетки лекарственных препаратов, в частности фрагментов нуклеиновых кислот, привлекаются достижения нанотехнологии [3, 4]. Удачный, продуманный выбор нановектора может на порядки повысить эффективность доставки лекарств в клетки.
2©
Рис. 1. Дифракционные картины наночастиц диоксида титана в аморфной форме (Amf) (темно-серая линия), форме брукита (Brt, светло-серая линия)и ана-таза (Anz, черная линия).
Диоксид титана широко используется в медицине как биосовместимый материал. Известно, что 1Ю2-наночастицы (~5 нм) проникают через клеточную мембрану [5, 6] и при облучении ультрафиолетовым светом способны разрушать бактериальные и вирусные DNA [7]. Продемонстрировано подавление роста раковых опухолей на культуре клеток человека в присутствии ТЮ2-на-ночастиц [8]. DNA-чипы на основе диоксида титана используются для анализа онкогенов и поиска мишеней для лекарств [9].
Информация о токсичности наночастиц противоречива. Размер, форма, состояние поверхности наночастиц влияют на их взаимодействие с биомолекулами [10]. 1Ю2-наночастицы проявляют меньшую цитотоксичность по сравнению с наночастицами никеля, кобальта и углерода [11]. В низких концентрациях они слабо влияют на выживаемость клеток [8].
Поверхность наночастиц TiO2 достаточно активна, что дает возможность проводить на ней как ковалентную, так и нековалентную иммобилизацию различных потенциальных лекарственных препаратов. Это позволяет рассматривать 1Ю2-на-ночастицы как перспективные транспортеры лекарственных препаратов, в частности фрагментов нуклеиновых кислот, в клетки.
Известно лишь небольшое число работ, касающихся иммобилизации олигонуклеотидов на поверхности диоксида титана [12—14]. В работе [12] предложен метод электрохимической иммобилизации олигонуклеотидов на анодный слой оксида титана на металлической поверхности. Иммобилизованные таким способом олигонуклеотиды
сохраняют способность к комплементарным взаимодействиям. В работе [13] DNA-фрагменты были иммобилизованы на поверхность TiO2 с использованием остатка катехола, и было показано, что при УФ-облучении композита происходит расщепление DNA. Иммобилизация олигонук-леотидов на поверхность TiO2, приготовленного в виде наноструктурированного покрытия на стекле, осуществлена при создании DNA-чипов, с предварительным введением аминогрупп на поверхность с помощью у-аминопропилтриэтокси-силана и ^-малеимидобутилоксисульфосукцини-мидного эфира [14]. Метод иммобилизации фрагментов DNA на ТЮ2-наночастицах, основанный на образовании ковалентной связи между остатком допамина в составе олигонуклеотида и OH-группа-ми на поверхности наночастиц диоксида титана представлен в работах [15—17]. Доставку созданных нанокомпозитов в клетки авторы осуществляли в основном с помощью электропорации.
Транспорт фрагментов нуклеиновых кислот в клетки — это только первый этап решения проблемы использования DNA-фрагментов в живых системах (в частности, в клетках). Другим важным аспектом является способность доставленных фрагментов к взаимодействию с внутриклеточными нуклеиновыми кислотами. Очевидно, что стерические препятствия в прочно связанных с наночастицами олигонуклеотидов могут уменьшать эффективность их действия. Поэтому предпочтительнее использовать нанокомпозиты, в которых олигонуклеотиды были бы связаны с нано-частицами нековалентно. В этом случае после проникновения нанокомпозитов в клетки DNA-фрагменты могут высвобождаться с поверхности носителя и успешно выполнять целевые функции.
В настоящей работе предложены эффективные методы получения нанокомпозитов TiO2~DNA, состоящих из наночастиц диоксида титана и нековалентно иммобилизованных фрагментов DNA, способных проникать через клеточные мембраны.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В данной работе наночастицы TiO2 в аморфной (Amf) и кристаллической (Brt, брукит и Anz, анатаз) формах были получены путем гидролиза тетрахлорида титана (TiCl4) или изопропоксида титана (Ti(O-iPr)4) аналогично описанному в работах [18, 19] с дополнительной обработкой образующихся золей глицидилизопропиловым эфиром.
Фазовый состав наночастиц определяли методами рентгенофазового анализа (РФА) и ИК-спектроскопии. По данным РФА (рис. 1), дифракционная картина образца Amf-формы представлена широкой полосой в виде гало в области углов 25°—40°, характерной для рентгеноаморф-ного диоксида титана. Образец Brt представлен в
основном фазой брукита с линиями в области 29.53°—35.95°. Однако не исключено, что в ВЛ-об-разце присутствует фаза анатаза, наиболее сильная линия которого является суперпозицией с линией брукита в области 29.46°. Основным отличием линий этих двух форм является асимметричность пика при 29°—31° и появление линии (121) при 36°. Другие линии анатаза проявляются в области 44.22°, 45.14°, 56.47°, 63.54°. Этим областям соответствуют максимумы на кривой Аш-образца ТЮ2.
ИК-спектры образцов ТЮ2, исследованных в данной работе, представлены на рис. 2а—в. Согласно спектральной базе данных диоксид титана с различной структурой характеризуется полосами поглощения от валентных колебаний связей Т1—О в области 400—700 см-1. Спектр рентге-ноаморфного ТЮ2 (рис. 2а) имеет четкие полосы поглощения при 407, 484, 620 см-1 и плечо в области 780 см-1. В его спектре отсутствуют полосы, которые могут быть отнесены к форме анатаза, брукита или рутила. ИК-спектр образца брукита (рис. 2б) представлен полосами при 550 и 760 см-1, которые типичны для этой фазы, и полосами 340 и 440 см-1, которые близки к колебаниям связей Т1-О в фазе рутила. ИК-спектр образца Аш; (рис. 2б) представлен полосами при 590, 750, 905 и 950 см-1, которые типичны для фазы анатаза. Примеси формы рутила идентифицируются появлением в ИК-спектре полос поглощения 340 и 420 см-1.
Все образцы имеют полосы в области выше 1200 см-1, относящиеся к физически адсорбированной воде и органическим примесям.
Размер частиц оценивали по области когерентного рассеяния) из данных РФА, МУРР и АСМ. По данным РФА область когерентного рассеяния в фазах брукита и анатаза составляет соответственно 2.5 и 5 нм. Средний размер частиц образцов ТЮ2 различной модификации, определенный из рентгенограмм МУРР, близок к данным РФА и составляет для аморфной формы ТЮ2 и формы анатаза 5-6 нм, для формы брукита 2.5 нм. Диаграммы МУРР распределения частиц диоксида титана с различной модификацией приведены на рис. 3.
Создание физиологических условий, необходимых для биологических экспериментов (добавление сильных электролитов (№С1), нейтральные значения рН), при
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.