ГЕНЕТИКА, 2015, том 51, № 8, с. 881-886
ГЕНЕТИКА РАСТЕНИЙ
УДК 633.18:632.488.42:575.11
СОЗДАНИЕ УСТОЙЧИВЫХ К ПИРИКУЛЯРИОЗУ СОРТОВ РИСА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДНК-МАРКЕРНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ
© 2015 г. Е. В. Дубина1, Ж. М. Мухина1, Е. М. Харитонов1, В. Н. Шиловский1, Е. С. Харченко1, Л. В. Есаулова1, Н. Н. Коркина1, Е. П. Максименко2, И. Б. Никитина2
всероссийский научно-исследовательский институт риса, Краснодарский край, пос. Белозерный 350921
e-mail: lenakrug1@rambler.ru 2Элитно-семеноводческое предприятие "Красное", Краснодарский край, пос. Рисоопытный 353810
Поступила в редакцию 29.07.2014 г.
На основе современных технологий молекулярного ДНК-маркирования проведено введение и пи-рамидирование генов резистентности к пирикуляриозу (Pi-ta, Pi-b, Pi-1, Pi-2, Pi-33) в отечественные сорта риса для придания им длительной устойчивости к заболеванию. Использованы SSR-мар-керы, тесно сцепленные с указанными генами, а также внутригенные маркеры генов Pi-ta, Pi-b. Разработана система мультиплексной ПЦР для идентификации в гибридном потомстве одновременно двух генов устойчивости к патогену — Pi-1 + Pi-2, Pi-ta + Pi-b, Pi-ta + Pi-33.
DOI: 10.7868/S0016675815060053
Одним из серьезных лимитирующих биотических стрессовых факторов для риса является пири-куляриоз (возбудитель несовершенный гриб Piric-ularia oryza Cav. (Magnaporthegrisea (Herbert) Barr)).
Всемирный институт микологии зарегистрировал это заболевание более чем в 80 странах и в последние годы отмечена высокая вредоносность этой болезни во всех рисосеющих регионах мира.
В 2013 г. эпифитотийная ситуация сложилась на рисовых полях Кубани (Краснодарский край). Пирикуляриозом оказалось поражено более 20% посевов риса. Потери урожая зерна составили 100—104 тыс. т (данные министерства сельского хозяйства и перерабатывающей промышленности Краснодарского края за 2013 г.).
Один из наиболее экономически эффективных способов борьбы с заболеванием — создание устойчивых сортов, что позволит одновременно сократить использование фунгицидов и минимизировать потери урожая. Применение современных биотехнологических методов (ДНК-маркирование) облегчает селекционную работу в данном направлении и позволяет ускоренными темпами создавать генисточники с интрогресси-рованными и пирамидированными генами резистентности к заболеванию.
Целью наших исследований является создание устойчивых к пирикуляриозу сортов и линий риса с использованием методов молекулярного маркирования. Особого внимания заслуживает создание сортов, несущих несколько пирамидирован-ных (объединенных в одном генотипе) генов устойчивости к патогену. Линии и сорта с тремя
генами резистентности более устойчивы к пирикуляриозу, чем линии с отдельными генами [1].
Исходя из поставленной цели в ходе исследований предусматривалось выполнение следующих задач.
1. Выполнить программу по введению и пира-мидированию генов устойчивости к пирикуляриозу Р1-1, Р1-2, РЫа, Р1-Ъ, Р1-33 в отечественные, высокопродуктивные сорта риса.
2. Провести оценку созданного селекционного материала на наличие в генотипе вышеуказанных генов методом ПЦР.
3. Разработать системы мультиплексной ПЦР для идентификации в гибридном потомстве одновременно несколько указанных выше генов.
4. Оценить созданный селекционный материал по комплексу селекционно важных признаков в условиях вегетационного и полевого опытов.
5. Выполнить фитопатологический тест для оценки созданного селекционного материала на устойчивость к краснодарской популяции патогена.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Донорами для введения генов устойчивости к пирикуляриозу в генплазму российских сортов риса Флагман и Снежинка стали сорта и линии зарубежной селекции 1Я-36 (донор гена Р—а), БЬ-1 (донор гена Р1-Ъ), С101ЬАС (донор генов Р1-1 + + Р1-33), С101А-51 (Р/-2). Предварительная оценка линий-доноров на чувствительность к местной популяции возбудителя пирикуляриоза путем инокуляции растений риса культурой гриба пока-
Нуклеотидные последовательности кодоминантных маркеров для идентификации аллельного состояния генов Pi-1, Pi-2, Pi-ta, Pi-b
Ген устойчивости Хромосомная локализация гена Маркер Сиквенс
Pi-1 11 RM224 F ATC GAT CGA TCT TCA CGA GG
R TGC TAT AAA AGG CAT TCG GG
RM144 F TGCCCTGGCGCAAATTTGATCC
R GCTAGAGGAGATCAGATGGTAGTGCATG
Pi-2 6 RM527 F GGC TCG ATC TAG AAA ATC CG
R TTG CAC AGG TTG CGA TAG AG
SSR140 F AAG GTG TGA AAC AAG CTA GCA A
R TTC TAG GGG AGG GGT GTA GAA
Pi-33 RM72 F CCG GCG ATA AAA CAA TGA G
R GCA TCG GTC CTA ACT AAG GG
RM310 F CCA AAA CAT TTA AAA TAT CAT G
R GCT TGT TGG TCA TTA CCA TTC
Pi-ta 12 Pi-ta F1 GCC GTG GCT TCT ATC TTTA CCT G
R1 ATC CAA GTG TTA GGG CCA ACA TTC
F2 TTG ACA CTC TCA AAG GAC TGG GAT
R2 TCA AGT CAG GTT GAA GAT GCA TAG A
Pi-b 2 Pi-b F4 CAT CAA CGA AGT CCA GCT CA
R5 CCG CGC TAT CTT GTA CAT TC
R6 CTC AGC ATA TGT GGC AGC TC
зала устойчивость тестируемых линий. Однако в условиях юга России данные линии-доноры проявили себя как позднеспелые, с вегетационным периодом 140—155 дней и характеризовались низкой фертильностью. В местной зоне рисосеяния возможно возделывание сортов, созревающих не более чем за 125 дней.
При гибридизации растений использовали пневмокастрацию материнских форм и опыление "'ТВЕЛЛ"—методом [2]. Перенос доминантных аллелей каждого гена в потомстве контролировался внутригенными, а также кодоминантными 88Я-маркерами (таблица) [3—5].
Образцы ДНК выделяли из свежесрезанной части листовой пластинки гибридных растений на стадии 4—5 листьев СТАВ-методом [6]. ПЦР проводили с предварительной оптимизацией ее параметров. Для разработки системы мульти-праймерной ПЦР при подборе комбинаций молекулярных маркеров, вносимых в реакционную смесь, учитывали температуру отжига, разницу в размерах ПЦР-продуктов, синтезируемых в ходе амплификации с праймерными парами, и само-комплементарность их последовательностей.
Для идентификации генов Pi-1, Pi-2, Pi-33 использовали известные из литературных источников праймерные пары фланкирующих SSR-локу-сов RM224 + RM144, RM527 + SSR140 и RM72 + + RM310 соответственно [7], для идентификации гена Pi-ta — праймерные пары кодоминантного маркера PitaF1/PitaR1 и PitaF2/PitaR2 [4], для идентификации гена Pi-b — праймерные пары кодоминантного Pi-bF4R5R6 [3].
Мультиплексную ПЦР проводили с 40—50 нг ДНК, 0.1 мкМ трифосфатов, 25 мМ KCl, 60 мМ Tris-HCl (pH 8.5), 0.1% Тритон Х-100, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 1.5 мМ MgCl2, 1 ед. Taq-поли-меразы и 0.3 мкМ праймеров в конечном объеме 25 мкл. Амплификацию осуществляли в ДНК-ам-плификаторе "Терцик", оптимизировав при этом условия ПЦР Это позволяет получать высокий выход целевых амплифицированных фрагментов наряду с минимальным количеством неспецифичных ампликонов для всех праймерных пар.
Условия ПЦР: начальная денатурация — 5 мин при 94°С — один цикл; 35 циклов: денатуация — 35 с при 94°С; отжиг праймеров 45 с при 60°С; синтез 30 с при 72°С; завершающий синтез 5 мин при 72°С — один цикл.
СОЗДАНИЕ УСТОЙЧИВЫХ К ПИРИКУЛЯРИОЗУ СОРТОВ РИСА
883
Продукты ПЦР разделяли электрофорезом в 8%-ном полиакриламидном геле на основе 1х ТВЕ буфера при напряжении 180 В 3 ч. После электрофореза гелевые пластины помещали на 20—30 мин в раствор бромистого этидия и фотографировали в ультрафиолетовом свете с использованием системы "Гель-документация".
Для оценки созданного селекционного материала на устойчивость к краснодарской популяции патогена лабораторией защиты риса проведен фитопатологический тест. Растения инокулировали культурой гриба, выделенной из гербарного материала, собранного на полях Краснодарского края, при 105 конидий/мл, что соответствует 10—14 спорам в поле зрения микроскопа. Растения заражали в полевых условиях инфекционного питомника в фазы кущение, выметывание — цветение из расчета 0.5 мл на одно растение. При обработке использовали опрыскиватель. В суспензию добавляли при-липатель Твин из расчета 1 капля на 1 л воды. В качестве контроля использовали устойчивый сорт риса Авангард. Учет степени поражения растений проводили на 14-е сут после инокуляции, учитывая интенсивность развития болезни (ИРБ, %) согласно экспресс-методу оценки сортовой устойчивости риса к пирикуляриозу [8]:
устойчивые — отсутствие поражения, мелкие коричневые пятна, покрывающие менее 25% общей поверхности листьев;
среднеустойчивые — типичные пирикуляриоз-ные пятна эллиптической формы, 1—2 см длиной, покрывающие 25.1—50% общей поверхности листьев;
неустойчивые — типичные пирикуляриозные пятна эллиптической формы, 1—2 см длиной, покрывающие 50.1% и более общей поверхности листьев.
РЕЗУЛЬТАТЫ
С использованием современной технологии молекулярного маркирования нами проведено введение генов резистентности к пирикуляриозу Pi-ta, Pi-b, Pi-1, Pi-2 в отечественные сорта риса для придания им длительной устойчивости к патогену Magnaporthe grisea.
В 2007 г. нами проведена гибридизация линий доноров генов устойчивости к пирикуляриозу с отечественными сортами. В результате по каждой комбинации получено F1 поколение, которое использовали в возвратных скрещиваниях с рекуррентными родительскими формами (отечественными сортами риса Флагман и Снежинка). В 2008 г. в камерах искусственного климата получено ВС1 и ВС2 поколения. Начиная с первого возвратного скрещивания проводился маркерный контроль на присутствие переносимых донорных аллелей в гибридном потомстве. Отбирали растения, кото-
рые по результатам ДНК-анализа несли донор-ный аллель гена устойчивости к патогену.
В 2009 г. получено ВС3 поколение. Начиная с этапа ВС^, дающего возможность перевести приоритетный аллель в гомозиготное состояние, проводился индивидуальный отбор. Отбирали растения, наиболее близкие по морфотипу к ре-ципиентной родительской форме и несущие, кроме того, донорные аллели генов устойчивости к патогену в гомозиготном состоянии.
По каждой комбинации было проведено четыре беккросса, поскольку известно, что восстановление генома рекуррентного родителя (КР) при возвратных скрещиваниях в ВС4 составляет 96.87% [7].
Далее для объединения генов устойчивости к патогену в одном генотипе в 2010 г. провели в разн
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.