ОНТОГЕНЕЗ, 2004, том 35, № 3, с. 220-228
ГЕНЕТИКА РАЗВИТИЯ =
УДК 575.11:579.254.2:582.232.7
СПАСЕНИЕ ИНСЕРЦИОННЫХ РЕЦЕССИВНЫХ ЛЕТАЛЬНЫХ
МУТАНТОВ АгаЫйорз1з МаНапа1
© 2004 г. О. А. Огаркова, А. А. Томилов, Н. Б. Томилова, В. А. Тарасов
Институт общей генетики им. НИ. Вавилова РАН 119991 Москва, ГСП-1, ул. Губкина, д. 3
Поступила в редакцию 07.08.03 г. Окончательный вариант получен 20.10.03 г.
Из созданной ранее методом агробактериальной трансформации прорастающих семян АгаЫйвр818 ШаНапа коллекции трансгенных растений, геном которых содержит инсерцию Т-ДНК векторной плазмиды pLD3 или pPCVRN4, отобрана группа из 13 рецессивных летальных мутантов. Использование сред, содержащих экзогенные гормоны, позволило компенсировать летальный эффект, идентифицировать фенотип и охарактеризовать генетически и молекулярно-генетически шесть линий рецессивных летальных проростков.
Ключевые слова: инсерционный мутагенез, экзогенные гормоны, спасение летальных проростков.
В конце 2000 г. была завершена расшифровка полной нуклеотидной последовательности первого вида высших растений - Arabidopsis thaliana (http://www.arabidopsis.org). Несмотря на то что генетика A. thaliana интенсивно разрабатывается в течение многих лет, функции большей части его генов не идентифицированы и сегодня. В результате в настоящее время на первый план вышла проблема идентификации функции генов A. thaliana, нуклеотидная последовательность которых уже определена.
Очевидно, что для установления связи между признаком и генетической детерминантой, определяющей этот признак, необходимо тем или иным образом изменить экспрессию этой детерминанты. Несмотря на то что в последние годы разработаны методы супрессии генной активности при помощи антисмысловых РНК (Bouchez, Hofte, 1998; Tissier et al., 1999), основным методом идентификации функции генов был и остается традиционный метод индукции мутаций.
Знание полной нуклеотидной последовательности принципиально меняет технологию процесса исследования структурно-функциональной организации генома. В частности, при идентификации функции генов это обстоятельство позволяет использовать метод генонаправленного мутагенеза, связанного с замещением интактного гена его мутантной копией путем использования гомологичной рекомбинации. Этот метод широко используется для многих модельных организмов,
1 Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (проекты < 99-04-48685, 02-04-49849).
таких как микроорганизмы и млекопитающие (Bouchez, Hofte, 1998), однако для высших растений его применение затруднено, поскольку процесс гомологичной рекомбинации в этом случае протекает с низкой эффективностью (Puchta, Hohn, 1996).
Успехи в исследовании функциональной организации генома A. thaliana связаны с разработкой методологии инсерционного мутагенеза (Azpiroz-Leehan, Feldmann, 1997; Bouchez, Hofte, 1998; Meissner et al., 1999), при этом решающую роль играет получение с помощью инсерционного мутагенеза коллекций мутантов. В настоящее время в ряде лабораторий мира такие коллекции уже получены (Krysan et al., 1999; Parinov et al., 1999; Speulman et al., 1999; Tissier et al., 1999; Огаркова и др., 2001).
Для характеристики фенотипа инсерционных мутантов A. thaliana, имеющих наследуемые морфологические изменения, как правило, используется классификация, впервые предложенная Фельдманном (Feldmann, 1991). Она включает в себя семь фенотипических классов, в том числе и класс "летальные проростки", составляющий 35% от всех получаемых инсерционных мутантов. Мутанты, относящиеся к этому классу, не формируют 1-ю пару настоящих листьев и гибнут в возрасте до двух недель.
Цель данной работы - спасение инсерционных рецессивных летальных проростков такого фенотипа для идентификации мутантного признака и гена, инсерция в который обусловливает этот фенотип.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Генетический материал. В качестве генетического материала в работе использовали коллекцию инсерционных морфологических мутантов, полученную методом агробактериальной трансформации прорастающих семян. Метод разработан Фельдманном и Марксом (Feldmann, Marks, 1987) в модификации (Огаркова и др., 1997; Томи-лов и др., 1999) с помощью бинарных векторных систем pLD3 (Гапеева и др., 1995), pPCVRN4 (Kon-cz et al., 1994) и супервирулентного штамма Agro-bacterium tumefaciens A-281.
Среды и условия культивирования. Проращивание семян проводили в стерильных условиях на агаризованной (0.8%) среде Квитко (1960) без витаминов и сахарозы, содержащей маркерные антибиотики (50 мг/л канамицина в случае вектора pLD3 и 30 мг/л гигромицина в случае вектора pPCVRN4).
При подборе условий спасения летальных проростков в качестве базовой использовали агари-зованную среду Квитко с добавлением 3% сахарозы и витаминов: 5 мг/л тиамина, 0.5 мг/л пиридок-сина, 0.5 мг/л никотиновой кислоты, 50 мг/л инозитола.
В качестве экзогенных гормонов использовали у-индолил-3-масляную кислоту (ИМК), а-наф-тилуксусную кислоту (НУК) и 6-бензиламинопу-рин (6-БАП).
Отбор трансформированных растений. Семена, подвергшиеся агробактериальной трансформации (Т1-поколение), выращивались асептически в почве и давали урожай (Т2-поколение). Отбор трансформированных растений проводили в следующем поколении (Т2), когда выборка из смешанного урожая семян Т1-поколения проращивалась в стерильных условиях на среде, содержащей соответствующий маркерный антибиотик.
Доказательство трансгенной природы трансформантов A. thaliana. Гистохимическое определение активности гена Р-глюкуронидазы (GUS) в тканях растений проводили по методу Джефферсона с соавторами (Jefferson et al., 1987).
Условия и праймеры для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) с целью быстрого обнаружения Т-ДНК у трансформированных растений описаны нами ранее (Томилов и др., 1999; Огаркова и др., 2001).
Определение числа инсерций Т-ДНК проводили методом блот-гибридизации по Саузерну. В качестве радиоактивного зонда использовался фрагмент Т-ДНК векторной плазмиды.
Изучение морфологии проростков. При использовании метода сканирующей электронной микроскопии все исследовавшиеся структуры проростков растений фиксировали в 4%-ном глю-
таральдегиде на 0.025 М фосфатном буфере (pH 7.0) при 4°С в течение 18 ч. Затем материал погружали в 2-4%-ный OsO4 на 24 ч при 4°С, 3 раза промывали фосфатным буфером, обезвоживали серией спиртов (30, 50, 70% - по 10-15 мин, 80, 96% - 15 мин и 100% - два раза по 30 мин) и далее переносили в 100%-ный ацетон на 1 ч. Образцы сушили в жидком СО2. Обработанные проростки, прикрепленные к столикам, напыляли Pt-Pd в ионном напылителе IB-3 ("Eiko", Япония) слоем 150А. В исследованиях использовали СЭМ S-405A ("Hitachi", Япония) с ускоряющим напряжением 15 кВ.
Сегрегационный анализ на наличие фенотипи-чески регистрируемых мутантных форм проводили в поколениях Т3, Т4 и Т5 трансформантов A. thaliana. В серии последовательных опытов на чашку Петри с агаризованной средой Квитко высевали в 1 мл стерильного 0.15%-ного агара семена из одного стручка (10-50 шт.), после чего инкубировали их при 22-25°С и 16-часовом люминесцентном освещении. Скрининг на наличие мутантных проростков проводили через 5-8 сут.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Получение мутантов класса "летальный проросток". Для индукции инсерционных мутантов в работе использовали модифицированный метод генетической трансформации прорастающих семян A. thaliana. Модификация, заключавшаяся в ультразвуковой обработке семян в присутствии окиси алюминия перед сокультивирова-нием с агробактериями, позволила увеличить эффективность процесса индукции мутаций не менее чем в три раза (Огаркова и др., 1997; Томилов и др., 1999).
При использовании этого метода отбор рецессивных мутантов проводили в третьем (Т3) после трансформации поколении растений. В Т1-поко-лении после сокультивирования прорастающих семян с агробактериями растения выращивали асептически в почве до стадии зрелых семян, после чего семена собирали тотально со всех растений. В Т1-поколении трансформанты представляли собой химерные растения. Отбор трансформированных растений проводили в следующем поколении (Т2), когда выборки из смешанного урожая семян Т1-поколения проращивали стерильно на синтетической среде с маркерными антибиотиками. Дополнительно при отборе трансформантов в Т2-поколении использовали и другие маркеры, тип которых определялся спецификой Т-ДНК вектора (Томилов и др., 1999; Огаркова и др., 2001), а также в этом поколении с помощью блот-гибридизации определяли число инсерций в геноме клеток растений-трансформантов.
a
jv t уЩЗРВ^^и I : Щ^ШкЛ
в г
Рис. 1. Аномалии в морфологии семядолей рецессивных летальных мутантов A. thaliana: верхняя (а) и нижняя (•) поверхность семядоли проростка линии 1599; проростки линии 1599 (в) и 76 (г). Масштаб: а - 150; б - 120; в, г - 300 мкм.
В Т2-поколении большая часть возникающих инсерционных мутаций находится в гетерозиготном состоянии, поэтому отбор рецессивных мутантов проводили в поколении Т3 среди отобранных в предыдущем поколении (Т2) фенотипичес-ки нормальных трансгенных растений, т.е. тогда, когда происходит выщепление гомозиготных му-тантных форм.
Характеристика мутантов. К фенотипичес-кому классу рецессивных летальных проростков отнесены линии растений, которые в ТЗ-поколе-нии показывали расщепление по фенотипу на нормальные и морфологически измененные формы, представлявшие собой проростки замедленного развития, прекращавшие рост на стадии семядолей, не формировавшие первую пару настоящих листьев и характеризовавшиеся летальностью в возрасте до 2-4 нед. Растения нормальной морфологии к 10-м сут проращивания имели значительно больший по сравнению с морфологически измененными формами размер, к 14-м сут у них, в отличие от морфологически измененных форм, образовывалась первая пара настоящих листьев. Семядоли мутантных проростков имели нарушения клеточной дифференцировки, аномальное развитие клеток эпидермиса (рис. 1) часто приводило к практически полному их отсутствию (рис. 1, б). Семядоли были неправильной формы (рис. 1, в), часто пережатые у основания (рис. 1, г),
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.