= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 582.232+637.17
СПЕКТР ДЕЙСТВИЯ МИКОЦИНОВ КЬиУУЕЮМУСЕЗ ЬАСШ
© 2013 г. В. И. Голубев
Всероссийская коллекция микроорганизмов, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов
им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино Поступила в редакцию 07.02.2012 г.
Обнаружены штаммы К1иуувготусв8 \actis, секретирующие микоцины фунгицидного действия при значениях рН среды от 5 до 7. Эта активность утрачивается после облучения культур УФ. Среди обследованных более 260 видов дрожжей чувствительные к данным микоцинам, в основном, выявлены в семействах Saccharomycetaceae и Wickerhamomycetaceae порядка Saccharomycetales.
Ключевые слова: микоцин, чувствительность, Saccharomycetaceae, Wickerhamomycetaceae.
БО1: 10.7868/80026365613010023
Секреция антифунгальных белков (микоци-ногения) — широко распространенный феномен среди представителей большинства родов дрожжевых грибов [1]. Следует, однако, отметить, что достаточно глубоко и разносторонне микоцино-гения изучена у единичных видов, в первую очередь, у Saccharomyces cerevisiae Meyen ex Hansen [2]. У других видов основное внимание обращено на исследование какого-либо одного аспекта этого явления: генетических детерминантов синтеза микоцина, его структуры или механизма действия. Скудная, как правило, информация имеется об одной из принципиальных характеристик микоцинов (киллер-токсинов) — спектрах их действия. Часто при этом ограничиваются весьма небольшим набором культур и обычно видами, имеющими значение для медицины или пищевой промышленности.
Вышесказанное относится и к клюйверомице-там, среди которых найдено немало микоцино-генных штаммов [3, 4]. Наиболее значительное количество работ посвящено Kluyveromyces lactis (Dombrowski) van der Walt, а именно изучению линейных ДНК плазмид, детерминирующих у него синтез микоцина (зимоцина) [5].
Ранее среди активно сбраживающих лактозу дрожжей нами были обнаружены культуры данного вида, обладающие антифунгальной активностью [6]. В настоящей работе представлены результаты исследования у них этой активности, и особое внимание уделено выявлению таксонов дрожжевых грибов, чувствительных к секретируе-мым K. lactis агентам.
1 Автор для корреспонденции (e-mail: wig@ibpm.pushchino.ru).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Штаммы. В работе использованы культуры Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ). Большинство обследованных видов дрожжей представлено их типовыми штаммами, а родов — типовыми видами. Обнаруженные активные штаммы K. lactis ВКМ Y-869 и Y-870 выделены, соответственно, из скисшего коровьего молока (Кольский полуостров, 1937 г.) и чала (Туркмения, 1948 г.), а штаммы ВКМ Y-1186 и Y-1343 - из коровьего молока (Белоруссия, 1947 и 1966 гг.) (http://www.vkm.ru).
Тестирование чувствительности. Чувствительность трехсуточных культур, выращенных на сусло-агаре (СА) при комнатной температуре (около 20°С), тестировали методом "культура против культуры". Водную суспензию клеток (0.05 мл, 105 клеток/мл) обследуемого штамма растирали шпателем по поверхности агаризованной среды подобранного состава (см. ниже). Затем штрихом наносили на нее инокулюмы четырех указанных выше штаммов, и чашки инкубировали при комнатной температуре до появления роста газона. При наличии вокруг штриха зоны подавления роста в несколько мм тестируемые штаммы регистрировали как чувствительные, при отсутствии зоны - как нечувствительные, при образовании узкой зоны, около 1 мм, штаммы относили к слабо чувствительным.
Получение и характеристика токсина. Для наработки токсина штаммы K. lactis выращивали в жидкой среде в покое. Клетки отделяли центрифугированием (5000 g, 10 мин), супернатант фильтровали через стеклянные фильтры GF/A ("Sigma", США). Полученную токсин-сод ержа-
100+
^ 80
д"
н о 60
о
<0
св 40
<ч
S
^
3
д
«20 b,
01-1 г- ♦ 1 » 1-¥
10 20 30 40 50 Часы
Гибель клеток Saccharomyces bayanus ВКМ У-443 (% от исходной концентрации 2.2 х 103 кл/мл) при инкубации в токсин-содержащей культуральной жидкости Kluyveromyces \actis ВКМ У-1186.
щую культуральную жидкость использовали для установления действия токсина на жизнеспособность чувствительных клеток, что в процессе инкубации их в ней определяли высевами на СА. Она использована также для проверки устойчивости токсина к повышенной температуре и про-теолизу методом лунок в агаре. Для ориентировочной оценки молекулярной массы токсина штамм BKM Y-1186 выращивали на среде для тестирования чувствительности, покрытой диализной мембраной ("Spectrum", США). После семи суток инкубации мембрану вместе с выросшей на ней культурой удаляли и поверхность среды засевали газоном чувствительного к токсину штамма S. bayanus Saccardo BKM Y-443.
Элиминация антифунгальной активности. Водную клеточную суспензию (0.1 мл) штаммов K. lactis BKM Y-870, 1186, 1343 высевали газоном на СА и инкубировали при максимальных для их роста температурах (36, 37 и 41°С). Другие чашки 3 мин облучали УФ.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Антифунгальная активность штаммов K. lactis ВКМ Y-869, -870, -1186 и -1343 проявляется при значениях рН среды в диапазоне от 5.0 до 7.0 (цитрат-фосфатный буфер). Наибольшие зоны подавления роста чувствительных культур наблюдали при рН 5.5 и 6.0. Они возрастали при внесении в среду 150 мл/л глицерина или 2% NaCl. Согласно этим данным тестирование чувствительности основного массива культур к сек-ретируемым указанными штаммами токсинам осуществлено на среде следующего состава (г/л): глюкоза — 5.0, пептон — 2.5, дрожжевой экстракт — 2.0, NaCl — 20.0, агар — 20.0 со значениями рН 5.5 и
6.0. Судя по ширине зон подавления роста, штамм ВКМ Y-1186 наиболее активен, к нему близок в этом отношении ВКМ Y-1343. Низкой активностью характеризовались остальные два штамма, особенно ВКМ Y-869. Наличие у последнего активности иногда не удавалось выявить при обследовании культур, слабо чувствительных к токсинам всех четырех штаммов K. lactis, включая и самый активный, BKM Y-1186.
Для наработки токсина штамм ВКМ Y-1186 выращивали трое суток в среде, содержащей в 1 л 40.0 г глюкозы, 20.0 г пептона, 10.0 г дрожжевого экстракта и 150 мл глицерина. Для получения активной токсин-содержащей кульуральной жидкости штамм ВКМ Y-869 приходилось инкубировать до 20 сут.
Секретируемый штаммом ВКМ Y-1186 агент полностью инактивируется после 5 мин выдерживания при 100°С, а также после обработки пепсином, проназами Е и Р ("Serva", Германия), про-теазами XIII, XIV из Streptomyces griseus и Aspergillus saitoi ("Sigma", США). Он не диффундирует через диализную мембрану, не пропускающую соединения с молекулярной массой 6—8 кДа и более.
В процессе инкубации чувствительных дрожжей в содержащей токсин культуральной жидкости количество жизнеспособных клеток уже в первые полчаса падает до 10—20% и далее продолжает снижаться, а спустя двое суток они вообще не обнаруживаются (рисунок).
После выращивания исследованных штаммов K. lactis при максимальных для их роста температурах на наличие антифунгальной активности проверено 223 случайно отобранные колонии. Активность оказалась утраченой у 14% колоний лишь штамма ВКМ Y-1186, и из них 8% стали чувствительны к токсину родительского штамма. Активность после роста при максимальных температурах сохранилась у всех проверенных 128 колоний штаммов BKM Y-870 и -1343.
После облучения УФ проверено 166 колоний, из них от 83 до 91% у штаммов ВКМ Y-870, -1186 и -1343 утратили активность. Все они у штаммов BKM Y-870 и 1343 оказались нейтрального фенотипа, тогда как у штамма ВКМ Y-1186 среди утративших активность 32% клонов стали чувствительны к токсину родительского штамма.
На чувствительность к секретируемым штаммами K. lactis агентам протестированы 584 штамма дрожжевых грибов, принадлежащих к 268 видам 105 родов. Не чувствительны к ним обследованные 95 видов (127 штаммов) базидиомицетных дрожжей 42 родов, за исключением лишь типовых штаммов одного вида Rhodotorula Harrison и двух видов Sporobolomyces Kluyver et van Niel, оказавшихся к ним слабо чувствительными (табл. 1).
СПЕКТР ДЕЙСТВИЯ МИКОЦИНОВ KLUYVEROMYCES ЫСШ 81
Таблица 1. Дрожжи, нечувствительные к микоцинам Шиууегошусе8 \actis (количество обследованных видов, штаммов)
Agaricostilbum (1, 1) Komagataella (1, 1) Schizoblastosporion (1, 15)
Ambrosiozyma (1, 1) Kondoa (1, 1) Schizosaccharomyces (1, 1)
Bensingtonia (1, 1) Kregervanrija (1, 1) Schwanniomyces (5, 6)*
Blastobotrys (2, 3) Kurtzmanomyces (1, 1) Sebacina (1, 1)
Brettanomyces (4, 17) Kwoniella (1, 1) Sirobasidium (1, 1)
Bullera (1, 1) Leucosporidiella (1, 1) Sporidiobolus (4, 4)
Bulleromyces (1, 1) Leucosporidium (1, 1) Sporobolomyces (13, 19)*
Candida (4, 5)* Lindnera (10, 35)* Starmera (4, 7)
Citeromyces (1, 1) Lipomyces (3, 7) Sterigmatomyces (1, 1)
Clavispora (1, 2) Magnusiomyces (1, 1) Sugiyamaella (1, 1)
Cryptococcus (1, 1) Mastigobasidium (1, 1) Sympodiomycopsis (1, 1)
Cuniculitrema (1, 1) Millerozyma (1, 1) Tausonia (2, 2)
Curvibasidium (1, 1) Mrakia (1, 1) Tetrapisispora (2, 2)
Cystofilobasidium (1, 1) Mrakiella (1, 1) Tilletiopsis (1, 1)
Debaryomyces (1, 1) Myxozyma (1, 1) Torulaspora (4, 4)
Dioszegia (1, 1) Nadsonia (2, 10) Tremella (1, 1)
Dipodasopsis (1, 1) Naumovozyma (1, 1) Trichosporon (1, 1)
Eremothecium (1, 1) Ogataea (10, 13)* Trigonopsis (1, 1)
Erythrobasidium (1, 1) Pachysolen (1, 1) Trimorphomyces (1, 1)
Fellomyces (1, 1) Peterozyma (1, 1) Udeniomyces (1, 1)
Fibulobasidium (1, 1) Pichia (1, 1) Vanderwaltozyma (1, 1)
Filobasidiella (1, 1) Pseudozyma (1, 1) Wickerhamia (1, 1)
Filobasidium (1, 1) Rhodosporidium (8, 24) Wickerhamiella (1, 1)
Geotrichum (1, 1) Rhodotorula (28, 36)* Xan thophyllomyces (1, 1)
Hanseniaspora (1, 1) Saccharomycodes (1, 5) Yamadazyma (1, 1)
Holtermannia (1, 1) Saccharomycopsis (1, 1) Yarrowia (1, 1)
Itersonilia (1, 1) Sakaguchia (1, 1) Zygoascus (1, 1)
Kockovaella (1, 1) Saturnispora (1, 1) Zygotorulaspora (2, 2)
Kodamaea (1, 1) Scheffersomyces (1, 1)
* Слабо чувствительны отдельные, включая типовые, штаммы видов C. glabrata, C. holmii, С. intermedia, C. milleri (см. также табл. 2), L. fabianii, L. jadinii, L. pet
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.