ХИМИЯ ВЫСОКИХ ЭНЕРГИЙ, 2014, том 48, № 2, с. 116-122
= ФОТОХИМИЯ =
УДК 535.34:535.37:577.112
СПЕКТРАЛЬНО-ФЛУОРЕСЦЕНТНОЕ ИЗУЧЕНИЕ НЕКОВАЛЕНТНОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ жезо-ЗАМЕЩЕННОГО ЦИАНИНОВОГО КРАСИТЕЛЯ С СЫВОРОТОЧНЫМИ АЛЬБУМИНАМИ
© 2014 г. А. С. Татиколов*, И. Г. Панова**
*Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН 119334, Москва, ул. Косыгина, 4 E-mail: tatikolov@mail.ru **Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН 119334, Москва, ул. Вавилова, 26 Поступила в редакцию 19.08.2013 г. В окончательном виде 18.10.2013 г.
Спектрально-флуоресцентными методами проведено сравнительное изучение нековалентного взаимодействия цианинового красителя-зонда 3,3'-ди-(у-сульфопропил)-4,5,4',5'-дибензо-9-этилтиа-карбоцианин-бетаина с сывороточными альбуминами различных позвоночных: крысы, кролика, быка и человека (соответственно САС, САК, САБ и САЧ). Показано, что при взаимодействии с САЧ краситель образует лишь один продукт — транс-мономер, связанный с САЧ, в то время как с другими альбуминами образуются также другие продукты связывания. Это, вероятно, объясняется более высокой энергией взаимодействия красителя с САЧ, чем с другими сывороточными альбуминами.
DOI: 10.7868/S0023119714020100
Сывороточные альбумины — основные транспортные белки позвоночных. Их главная функция — доставлять разнообразные молекулы, в которых нуждается организм, в ткани-мишени. Эта функция основана на свойстве сывороточного альбумина связывать различные молекулы-лиган-ды [1, 2]. На этом же свойстве основано и применение спектрально-флуоресцентных зондов для обнаружения сывороточного альбумина в биологических системах; при этом зонды, нековалентно связываясь с молекулой альбумина, демонстрируют рост флуоресценции и спектральные сдвиги, что позволяет детектировать даже малые концентрации биополимера (при таком связывании основную роль обычно играют Кулоновские и гидрофобные взаимодействия) [3]. Ранее нами был разработан спектрально-флуоресцентный зонд для САЧ — мезо-замещенный цианиновый краситель 3,3' -ди-(у-сульфопропил)-4,5,4' ,5' -дибензо-9-этилтиакарбоцианин-бетаин (ДЭЦ), успешно примененный для обнаружения и количественного анализа альбумина в стекловидном теле глаза человека [4, 5]. Оказалось, что в условиях эксперимента (при изучении стекловидного тела глаза человека и некоторых позвоночных животных) краситель ДЭЦ эффективно взаимодействует лишь с САЧ, но не с альбуминами других животных, что характеризует его специфичность как зонда для САЧ [6, 7]. Для более подробного иссле-
дования специфичности данного красителя по отношению к альбуминам в настоящей работе спектрально-флуоресцентными методами проведено сравнительное изучение нековалентного взаимодействия ДЭЦ с сывороточными альбуминами крысы, кролика, быка и человека.
ДЭЦ
МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА
Краситель ДЭЦ был предоставлен проф. Б.И. Шапиро (НЦ НИИХИМФОТОПРОЕКТ); использовали альбумины САС, САК, САБ и САЧ фирмы "Sigma". Чистота красителя контролировалась с помощью тонкослойной хроматографии. Изучение взаимодействия красителя с альбуминами проводилось путем титрования водного раствора красителя концентрированными растворами альбуминов (10-5, 10-4 и 10-3 моль/л), с периодической регистрацией спектров поглощения, флуоресценции и возбуждения флуоресценции изучаемого раствора красителя.
А 0.15
0.10
0.05
550 600
X, нм
700
Рис. 1. Спектры поглощения (1—12), флуоресценции (13, 14) и возбуждения флуоресценции (15—17) водного раствора ДЭЦ (с = 1.6 х 10-6 моль/л) при его титровании САЧ: [САЧ] = 0 (1), 3.2 х 10-7 (2), 6.0 х 10-7 (3), 7.6 х 10-7 (4), 9.2 х 10-7 (5), 1.1 х 10-6 (б), 1.2 х 10-6 (7), 1.5 х 10-6 (8), 1.8 х 10-6 (9), 2.5 х 10-6 (10), 3.4 х 10-6 (11), 5.7 х 10-6 (12), 3.3 х 10-8 (15), 1.4 х 10-7 (13, 16) и 3.6 х 10 7 (14, 17) моль/л. Для спектров флуоресценции Хех = 590 нм, для спектров возбуждения флуоресценции Хгег = 630 нм.
В качестве растворителя использовалась дистиллированная вода; концентрация красителя при титровании составляла около (1.5—2) х 10-6 моль/л.
Измерения спектров поглощения проводились на спектрофотометрах "8Ытаё2и ЦУ-3101 РС" (Япония) и СФ-2000 (Россия), флуоресцентные измерения — на спектрофлуориметре "Флю-орат-02-Панорама" (Россия) в стандартных кварцевых кюветах с длиной оптического пути 1 см. Оптическая плотность растворов не превышала 0.10—0.15. Спектры флуоресценции и возбуждения флуоресценции корректировались на спектральную характеристику канала возбуждения (сигнал опорного канала) и на сигнал пропускания образца.
Все измерения проводились при комнатной температуре.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Спектр поглощения водного раствора ДЭЦ при сравнительно малых концентрациях ((1—5) х х 10-6 моль/л) представляет собой полосу с максимумом X тх = 535 нм и плечом при ~570 нм, обусловленную поглощением соответственно ди-меров и цис-мономеров красителя, находящихся в равновесии (ни димеры, ни цис-мономеры не флуоресцируют) [8]. При введении САЧ в раствор
ДЭЦ спектр поглощения красителя резко изменяется: появляется полоса с X "ЬГ = 610 нм, обусловленная образованием интенсивно флуоресцирующего транс-мономера красителя, связанного с альбумином (при взаимодействии с альбумином цис-изомер красителя переходит в транс-изомер) [9]. Эволюция спектров поглощения водного раствора ДЭЦ при введении возрастающих концентраций САЧ (титровании концентрированным раствором САЧ) указывает на постепенный переход свободного красителя (в виде димеров и цис-мономеров) в связанный с альбумином (транс-мономеры) (рис. 1). При этом спектры возбуждения флуоресценции на всех этапах титрования соответствуют спектру поглощения связанного красителя (т.е. спектру поглощения, регистрируемому при большой концентрации САЧ), а спектры флуоресценции — спектру флуоресценции связанного
красителя (с Xтах ~ 622 нм, см. рис. 1), что указывает на образование только одной связанной формы ДЭЦ. На образование транс-мономерной формы в комплексе с САЧ указывает также то, что спектр поглощения связанного красителя близок по форме и положению к спектру транс-изомера ДЭЦ, зарегистрированного ранее в диоксане и обратных мицеллах АОТ [8]. Таким образом, в случае взаимодействия красителя ДЭЦ с САЧ наблюдает-
ся сравнительно простое равновесие между свободным и связанным красителем (1):
САЧ
1/2Д цис-М-- транс-М^САЧ, (1)
где Д — димер, цис-М — цис-мономер, транс-М^САЧ — транс--мономер, нековалентно связанный с САЧ.
В отличие от САЧ, взаимодействие ДЭЦ с другими сывороточными альбуминами является более сложным процессом и протекает сходным образом для САС, САК и САБ. При введении очень малых концентраций САС и САК (порядка (2—5) х 10-8 моль/л) в раствор ДЭЦ в спектре поглощения появляется и возрастает длинноволновое плечо в области 580—660 нм за счет появления широкой малоинтенсивной полосы (рис. 2а, 3а). Поскольку известно, что в присутствии малых концентраций альбумина часто происходит образование агрегатов полиметиновых красителей, полосы поглощения которых обладают низкими коэффициентами экстинкции [9], есть основание считать, что появляющаяся широкая полоса поглощения вызвана в основном образованием агрегатов (вероятно, неупорядоченных агрегатов, аналогично наблюдавшимся ранее в [10]). При дальнейшем повышении концентрации САС и САК (вплоть до (2—3) х 10-7 моль/л) эта полоса растет (т.е. агрегация усиливается), и лишь при концентрациях порядка 7 х 10-7 моль/л агрегаты начинают частично распадаться с появлением полосы с X "Г = 585—590 нм. Если начать титрование красителя сразу с более высоких концентраций альбумина (около 7 х 10-7 моль/л), агрегация прояв-
г г- л max
ляется слабее, а образующаяся полоса с Xabs = = 585—590 нм имеет более высокую интенсивность, которая продолжает возрастать при дальнейшем титровании, пока весь краситель не израсходуется (рис. 2б, 3б). Меньшее образование агрегатов в последнем случае можно объяснить тем, что процесс формирования агрегатов на биополимере протекает во времени, и при введении сразу больших концентраций альбуминов более интенсивно протекают более быстрые при данных условиях процессы образования других связанных форм красителя с альбуминами.
Следует отметить, что САБ слабее стимулирует агрегацию ДЭЦ, чем САС и САК: при малых концентрациях САБ ((2—5) х 10-8 моль/л) полоса поглощения агрегатов в области 580—660 нм практически отсутствует и появляется лишь при [САБ] = (3—5) х 10-7 моль/л. При дальнейшем повышении концентрации САБ полоса агрегатов вместе с полосой поглощения исходного красителя переходит в полосу с максимумом около 590 нм (рис. 4).
-т г г л max
Таким образом, образующаяся полоса Xabs = = 585—590 нм принадлежит, очевидно, основному продукту взаимодействия красителя с альбуминами.
В спектре флуоресценции при титровании ДЭЦ растворами САС, САК или САБ наблюдается появление и рост полосы с X |"ax = 615—620 нм,
имеющей спектр возбуждения с X max = 605—610 нм. По аналогии с САЧ можно принять, что данная полоса принадлежит транс-мономеру ДЭЦ, связанному с альбумином. Полоса поглощения с X masx = = 585 нм в спектрах возбуждения флуоресценции практически не проявляется (лишь как слабое
коротковолновое плечо на полосе с Xmax = 605— 610 нм), что указывает на сравнительно слабую флуоресценцию соответствующего продукта. В присутствии САС и САК в спектрах ДЭЦ могут также присутствовать полосы поглощения и флуоресценции в области 650—655 нм, принадлежащие, вероятно, J-агрегатам красителя (рис. 3) [8].
Таким образом, наиболее сильно флуоресцирующий продукт при взаимодействии ДЭЦ с САС, САК и САБ, как и с САЧ, — транс-мономер красителя, связанный с альбумином. Однако в то время как в случае САЧ он является единственным продуктом, в случае других альбуминов основным является продукт с X ambasx = 585 нм (главный в спектрах
поглощения), а продукт с Xmax = 605—610 нм (транс-мономер) проявляется в спектрах поглощения лишь как слабое длинноволновое плечо в спектре основного продукта. Поскольку агрегаты (в том числе димеры) полиметиновых кра
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.