ХИМИЯ ВЫСОКИХ ЭНЕРГИЙ, 2011, том 45, № 6, с. 553-558
= ФОТОХИМИЯ =
УДК 535.34:577.114
СПЕКТРАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ НЕКОВАЛЕНТНОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ТИАКАРБОЦИАНИНОВЫХ КРАСИТЕЛЕЙ С ГИАЛУРОНОВОЙ
КИСЛОТОЙ
© 2011 г. Т. М. Акимкин*, А. С. Татиколов*, И. Г. Панова**, С. М. Ярмолюк***
* Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН 119334, Москва, ул. Косыгина, 4 E-mail: tatikolov@sky.chph.ras.ru ** Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН 119334, Москва, ул. Вавилова, 26 *** Институт молекулярной биологии и генетики НАНУкраины Украина, 252143, Киев, ул. Заболотного, 150 Поступила в редакцию 31.03.2011 г. В окончательном виде 03.05.2011 г.
По спектрам поглощения изучено нековалентное взаимодействие с гиалуроновой кислотой (ГК) четырех тиакарбоцианиновых красителей сходного строения: 3,3',9-триметилтилтиакарбоцианина (Cyan 2), 3,3'-диметилтиакарбоцианина (Cyan 45), 3,3'-диэтилтиакарбоцианина (DTC) и 3,3'-ди-этил-9-метилтиакарбоцианина (DMTC). Показано, что в присутствии ГК красители Cyan 2, Cyan 45 и DMTC образуют Н-агрегаты, что отражается в появлении коротковолновой полосы поглощения с максимумом при 440—450 нм. По склонности к Н-агрегации в присутствии ГК красители можно расположить в ряд Cyan 2 > Cyan 45 > DMTC > DTC. Определено число агрегации Cyan 2 n = 3. В буферных растворах с рН 4.5, 7.0 и 9.1 полосы поглощения Н-агрегатов Cyan 2 более длинноволновые (с максимумами 460—470 нм), чем в отсутствие буферов. Cyan 2 предложен в качестве спектрального зонда для обнаружения ГК в биологических системах.
Гиалуроновая кислота является одним из важнейших биополимеров в живых организмах. Она представляет собой линейный полисахарид — не-сульфатированный гликозаминогликан, мономерное звено молекулы которой изображено ниже:
Молекулярная масса ГК может достигать нескольких миллионов [1].
ГК встречается в различных биосистемах, в частности, во внеклеточных средах, таких как стекловидное тело глаза, синовиальная жидкость и др. В связи с этим в ряде медико-биологических исследований было бы полезно иметь простые и в то же время чувствительные методы ее обнаружения и количественной оценки ее концентрации в исследуемой системе. Одним из таких методов могло бы быть использование спектрально-флуоресцентных красителей-зондов. Весьма перспективны в этом отношении полиметиновые (цианиновые) красители (ПК).
Ранее было показано, что ПК, демонстрируя большое разнообразие спектрально-флуоресцентных свойств в зависимости от строения их молекул, в то же время обладают способностью к изменению своих спектральных характеристик в различных средах [2]. Кроме того, важным свойством ПК является образование, в зависимости от условий, упорядоченных агрегатов различного типа (димеров, Н- и ^агрегатов) [3]. Подобные агрегаты ПК могут образовывать также в присутствии биополиэлектролитов [4—8]. Эти свойства делают данный класс красителей перспективным для поиска новых эффективных спектрально-флуоресцентных зондов как для ГК, так и для других биополимеров, что обусловливает актуальность изучения нековалентного взаимодействия ПК с биомакромолекулами.
Поскольку макромолекулы ГК имеют отрицательный заряд, катионные ПК должны взаимодействовать с ней за счет электростатического притяжения. Ранее было обнаружено, что некоторые ка-тионные ПК образуют агрегаты в присутствии ГК: 3,3'-диэтил-9-метилтиакарбоцианин — димеры [7], а 3,3'-диэтил-5,5'-дихлортиамонометинцианин — I-агрегаты [8]. Однако не проводилось систематического изучения поведения ПК в присутствии ГК в зависимости от структуры красителей или среды. В настоящей работе спектрально-флуоресцентными
Рис. 1. Нормированные спектры поглощения ПК Cyan 2 при концентрациях 9.0 х 10-6 (1) и 2.4 х 10-7 (2) моль/л, разностный спектр (3) в коротковолновой области поглощения (спектр 1 минус спектр 2). Шкала по оси ординат соответствует спектру 1.
методами изучено нековалентное взаимодействие с ГК ряда катионных ПК со сходной структурой:
С^МЧЮ
I I
R1 I- R1
R1 = R2 = CH3 (Cyan 2);
R1 = CH3, R2 = H (Cyan 45);
R1 = C2H5, R2 = H (DTC);
R1 = C2H5, R2 = CH3 (DMTC).
МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА
Спектры поглощения измерялись на спектрофотометрах "Shimadzu UV-1601" и СФ-2000 в стандартных кюветах с длиной оптического пути 1 и 5 см (данные, полученные в 5-см кюветах, пересчитыва-лись на длину оптического пути 1 см). В эксперименте использовалась ГК в виде натриевой соли ("Sigma"), красители Cyan 2 и Cyan 45, синтезированные согласно методикам [9] и проверенные на чистоту методом тонкослойной хроматографии на силикагеле, а также красители DTC ("Sigma") и DMTC. Вследствие плохой растворимости в воде красители вводились в водный раствор путем добавления небольшого объема концентрированного
раствора в ДМСО (разбавление 1 : 500-1 : 1000). Концентрации красителей определялись спектро-фотометрически с использованием коэффициентов экстинкции для Cyan 2 2.9 х 104 л/(моль см) на длине волны 535 нм, для Cyan 45 8.3 х 104 л/(моль см) на длине волны 552 нм [10] и для DTC 1.0 х х 105 л/(моль см) на длине волны 552 нм. При титровании красителей концентрированным раствором ГК (6.3 х 10-3 моль/л) концентрация красителя выбиралась в пределах (2-9) х 10-6 моль/л, а концентрация гиалуроновой кислоты (выражаемая в молях ее мономеров на литр) возрастала от 0 до 9.3 х 10-4 моль/л. При анализе спектров поглощения учитывалось разбавление раствора красителя во время титрования.
В качестве растворителя использовалась дистиллированная вода; эксперименты проводились как непосредственно в воде, так и в водных фосфатных буферных растворах (0.02 моль/л), приготовленных из солей Na2HPO4 и KH2PO4 (ч.д.а.), с pH 4.5, 7.0 и 9.1.
Все измерения проводились при температуре 23 ± 2°C.
При разложении спектров поглощения на 1аус-совы компоненты использовалась минимизация среднеквадратичного отклонения модельных спектров от экспериментальных с использованием программы "Excel".
РЕЗУЛЬТАТЫ
В водном растворе спектры поглощения изучаемых красителей при достаточно низких концентрациях (<1 х 10-6 моль/л) представляют собой полосы, характерные для мономерных ПК, с максимумами
^mbT = 535-555 нм и коротковолновым плечом при 490-525 нм, обусловленным электронно-колебательным переходом [11, 12]. При более высоких концентрациях ПК агрегируют, причем вначале образуются димеры красителей, поглощающие в коротковолновой области вблизи электронно-колебательного плеча [13]. При дальнейшем повышении концентрации образуются агрегаты более высокого порядка (тримеры, тетрамеры и др.), поглощающие в более коротковолновой области - H-агрегаты [3].
Агрегация в водных растворах показана в настоящей работе на примере красителя Cyan 2 (рис. 1). При сравнении спектра поглощения более концентрированного раствора Cyan 2 (9.0 х 10-6 моль/л) (рис. 1, спектр 1) со спектром его разбавленного раствора (2.4 х 10-7 моль/л) (рис. 1, спектр 2) видно, что при более высокой концентрации возрастает вклад поглощения в коротковолновой области спектра. Разностный спектр (рис. 1, спектр 3) имеет максимум около 490 нм, близкий к электронно-колеба-
тельному плечу и обусловленный, очевидно, образованием димеров красителя.
Агрегация ПК может также происходить при введении в раствор биомакромолекул [4—8]. Часто в присутствии биомолекул не наблюдается появления новых полос поглощения, а только падение исходной полосы мономерного красителя, что обусловлено образованием неупорядоченных агрегатов красителя на биомолекулах, имеющих низкие коэффициенты экстинкции [5], но во многих случаях агрегация сопровождается возникновением новых полос поглощения. В настоящей работе обнаружено появление полос поглощения агрегатов в присутствии ГК. Так, титрование ГК раствора Cyan 2 (9.0 х х 10-6 моль/л) приводило к возрастанию коротковолновой полосы в области поглощения H-агрега-
тов (с X Г = 446 нм) за счет падения исходной поло/ л max
сы поглощения мономерного красителя (с A abs = = 535 нм; рис. 2).
Особенностью данного процесса является его "пороговый" характер: в ходе титрования полоса Н-агрегатов перестает расти при падении концентрации Cyan 2 до ~4.6 х 10-6 моль/л. Аналогично, полоса Н-агрегатов не появляется при титровании ГК раствора Cyan 2, если [Cyan 2] < 4.6 х 10-6 моль/л.
Поскольку рост полосы Н-агрегатов не сопровождается ростом полосы димеров в области 490 нм, образование димеров не является начальной стадией образования Н-агрегатов, и последние, вероятно, образуются непосредственно из мономеров, что может объяснить "пороговый" характер процесса.
Число мономеров n в Н-агрегате можно оценить исходя из схемы равновесия:
nDye + HA < K > Dyen • HA,
(1)
где Dye и HA — соответственно молекулы красителя и ГК и Dyen • HA — агрегат (Aggr) из n молекул Cyan 2 на молекуле ГК. Тогда константа равновесия K равна:
K =
[Aggr]
(2)
[Dye]n[HA] lgK = lg [Aggr] - nlg [Dye] - lg [HA]. (3)
Поскольку [Dye] = Am/sm и [Aggr] = Aa/sa, где AM, sM, Aa и sA — оптические плотности и коэффициенты экстинкции мономерного красителя и агрегатов соответственно, то
nlg (Am) = lg (Aj[HA]) - lg (s a/Sm) - lgK. (4)
Из наклона логарифмической зависимости поглощения мономерного красителя от отношения A^HA] в ходе титрования можно определить число мономеров n в агрегате и (зная sA/sM) константу равновесия K.
0 400
450
500 X, нм
550
600
Рис. 2. Спектры поглощения ПК Cyan 2 (9.0 х х 10~6 моль/л) в присутствии возрастающих концентраций ГК: [HA] = 0, 4.6 х 10-7, 1.9 х 10-6, 4.6 х 10-6, 1.0 х 10-5, 2.1 х 10-5, 4.1 х 10-5, 6.1 х 10-5, 8.0 х 10-5, 9.7 х 10-5 и 1.1 х 10-4 моль/л.
Для оценки n в случае агрегации Cyan 2 на ГК величины AM и Aa измерялись на длинах волн 534 и 447 нм соответственно. Зависимость в координатах lgAM—lg(AA/[HA]) приведена на рис. 3. Линейный характер зависимости показывает, что в системе образуются агрегаты главным образом одного типа. Из ее наклона была получена величина n = 3.3 с коэффициентом корреляции r2 = 0.99. При исключении из рассмотрения точки, соответствующей самой малой концентрации ГК, когда агрегаты могли еще не вполне сформироваться, получили n = 3.0 с коэффициентом корреляции r2 = 1
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.