БИОФИЗИКА, 2015, том 60, вып. 1, с. 65-72
МОЛЕКУЛЯР НАЯ БИОФИЗИКА
УДК: 571.27, 577.32, 577.29
СПЕКТРАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИ СТИКИ И МОНОСАХАРИДНЫЙ СОСТАВ П РОТИВОВИРУСНОГО ПОЛИСАХАРИДНОГО ИНДУКТОРА ИНТЕРФЕРОНА ИЗ Heliantnus tuberosus L.
© 2015 г. Е.А. Генералов
Физический факультет Московского государственного университета им. М В. Ломоносова,
119991, Москва, Ленинские горы, 1/2
E-mail: generals1179@gmail.сот Поступила в p едакцию 22.07.14 г.
Представлены pезультаты спектрального и моносахаридного анализа полисахарида из Heliantnus tuberosus L. и изучены его интерферониндуцирующие свойства. На основании спектральных характеристик и моносахаридного состава сделан вывод о принадлежности полисахарида к классу глюканов, предположительно - ß-глюканов. Показано, что полисахаридный комплекс из клеточной стенки Heliantnus tuberosus L. проявляет интерферониндуцирующие свойства как в опытах in vitro, так и in vivo. Выдвинуто предположение, что в моделях, простимулированных полисахаридом, вырабатывается интерферон всех трех видов - а, ß, у. Были показаны противовирусное и терапевтическое действия полисахарида.
Ключевые слова: углевод, полисахарид, Heliantnus tuberosus L., индуктор интерферона, инфракрасная спектроскопия, УФ, моносахаридный состав, противовирусный.
В настоящее время в мире наблюдается стабильный рост вирусных заболеваний - ВИЧ, C ПИД, гр ипп, различные виды энцефалитов и др. Помимо ро ста заболеваемости, отмечается увеличение разнообразия вирусов - HjNj, H7N9, H7N9 и др. В связи с этим существует актуальная задача разработки лекарственных средств, эффективных для предотвращения и лечения вирусных заболеваний.
В совр еменной литератур е описано большое количество веществ, обладающих способностью к индукции синтеза интерферонов (ИФ) in vitro и in vivo [1,2]. По своей природе такие вещества можно разделить на вирусные и невирусные индуктор ы. Как правило, вирусы являются индукторами ИФ, который обусловливает развитие в клетках и организме антивирусного со -стояния. C другой стороны, интерферонинду-цир ующими свойствами обладают Т - и В-кле-точные митогены (ConA, ФГА, ЛПС), имму-номодуляторы бактериального и растительного происхождения, что позволяет судить об интерфероне как о биологической субстанции, продуцируемой клетками и обладающей полифункциональной активностью, связанной в том числе с клеточными TLR-рецепторами [3,4]. С истемы интерферонов являются важным звеном в формировании иммунных процессов, иг-
Сокращение: ИФ - интерферон.
рая ключевую роль в активации лимфоидных клеток, презентации антигена при заражении клеток вирусом, за счет связи и взаимодействия с иммунными рецепторами и активации клеточного иммунитета [5,6]. Однако токсичность уже известных препаратов является основным лимитирующим фактором их использования.
Поэтому поиск новых нетоксичных индукторов ИФ является актуальной задачей. Особый интерес представляют индукторы ИФ растительного происхождения.
Целью настоящей работы было выделение, очистка и изучение физико-химических характеристик и способности стимулировать биосинтез интерферона в организме мышей in vivo, а также в культуре клеток крови здоровых доноров in vitro нового природного полисахарида из Heliantnus tuberosus L.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Получение экстракта Heliantnus tuberosus L.
Клубни Heliantnus tuberosus L. пр омывали про -точной водой и сушили на воздухе. Отделяли кожуру и измельчали электрической мясорубкой. Измельченное сырье заливали горячей (100°С) дистиллированной водой в соотношении 1:1 (w:w) при постоянном пер емешивании. Через 4 ч экстракт центрифугировали при 8000 g в течение 20 мин для удаления нерастворимых
частиц. Супернатант очищали и концентриро -вали на установке SartoJet (Sartorius stedim biotech) против дистиллированной воды с отсечением веществ с молекулярной массой менее 300 кДа с использованием фильтров Sarto^n Sl^e Cassette (ро1уеШегеиИЪпе), а затем высушивали лиофильно.
Ф ракцию с диапазоном молекулярных масс 1-2 МДа загружали в колонку ХК 26/70 (26 мм х 70 см), упакованную Toyopear1 HW -75 Fine (TSK-Gel, Toyo Soda), ур авновешенную 0,01 М тр ис-буфером рН 6,6, затем элюировали тем же р аствором. Колонку калибр овали дек-странами Т-серии: Т - 100, T - 80, T - 40, T -20, T - 10 и голубым декстраном молекулярной массы - 1-2 МДа (Sigma-Aldrkh, США). Детекцию проводили при длинах волн 210 и 280 нм, также использовали кондуктометр.
Для определения молекулярного веса стр ои-ли логарифмическую калибровочную кривую, используя Exce1 2010, для зависимости Kav (константа доступности) от молекулярного веса стандартов. Kav рассчитывали по следующей формуле:
* - V^Vo
av V - V0'
t
где Vt - общий объем колонки; V0 - свободный объем колонки (обычно рассчитывается по выходу голубого декстрана); Ve - максимальное значение пика элюции изучаемого вещества.
Полученные после гельфильтрации фракции собирали, диализовали и лиофилизовали для дальнейшего исследования.
УФ-спектроскопия. УФ -спектры поглощения регистрировали на спектр офотометре UV-1800 Shimadzu в кюветах с длиной оптического пути 1 см, в диапазоне длин волн 190-1100 нм. Растворы образцов полисахаридов с концентрацией 1 мг/мл перед измерением центрифугировали в течение 15 мин при 8000 об/мин.
Инфракрасная спектроскопия. Для снятия ИК-спектров использовали спектр ометр IR Af-finity-1 FTIR System (Shimadzu Coloration, Токио, Япония) с приставкой полного внутреннего отражения - ATR MIRade-10 (Алмаз/ZnSe-призма) - (PIKE TeAnologies, Мэдисон, штат Висконсин, США), с разрешением 4 см-1. В качестве образца использовали гомогенные порошки различных фракций. Разложение контура полос в спектре делали с использованием пакета ACDLabs/Spectrus после стандартной процедуры ATR-коррекции базовой линии. Спектры регистрировали в диапазоне от 4000 до 400 см-1.
Моносахаридный анализ. Кислотный гидро -лиз полисахарида проводили 2 М трифторук-сусной кислотой в течение 1 ч при температуре 121°C, после чего остужали до комнатной температуры и высушивали [7,8]. После разведения смесью воды и малтитола гидролизаты анализировали на хроматографе Рготшепсе Series HPLC (Shimadzu Coloration, Токио, Япония) с фотодиодным детектором и колонкой Shodex Asahipak NH2P-50 4E (4,6 х 250 мм). Исследование проводили при условиях 1 мл/мин поток, 25-3% фосфорной кислоты, 75% - ацетонитри-ла, пр и температуре 50°C. И сследуемые обр азцы анализировали параллельно со стандартными обр азцами, содержащими GkA, GalA, Rha, Ara, Man, Glu, Gal, Бис, Xyl. Коэффициенты опр е-деляли относительно внешнего стандарта - мал-титола.
Индукция интерферона in vitro. Полисахарид из Heliantnus tuberosus L., в различных дозировках, вводили однократно подкожно, внут-рибрюшинно, внутримышечно и внутривенно мышам линии C57Black/6.
Индукцию интерферона проводили на про -бах цельной крови in vitro, полученной от 10 здоровых доноров по модифицированной методике C.C. Гр игорян с соавт. [9]. Ра створ полисахарида и госсипол исследовали на способность к индукции биосинтеза ИФ в концентра -циях 10 и 50 мкг/мл ростовой среды, культивируя клетки крови в пластиковых 96-луночных панелях в объеме 0,2 мл на лунку в трех повторах в течение 24 ч в CО2 инкубаторе. В качестве положительных контр олей интер феро -ниндуцирующей активности на клетках крови использовали широко известный индуктор у-ИФ стафилококковый энтеротоксин А в концентрации 10 мкг/мл и общепринятый индуктор а-ИФ вирус болезни Ньюкасла в инфекционной дозе 105 в 0,2 мл.
Индукция интерферона in vivo. Индукцию ИФ in vivo госсиполом [10] и полисахаридом изучали на мышах линии C57Black/6, полученных из питомника лабораторных животных «Cтолбовая» РАМН. Госсипол и углевод вводили животным внутрибрюшинно в объеме 0,2 мл по 25 мкг/мл. Через 6 ч после введения этих агентов в пробах крови микрометодом определяли уровень сывороточного интерферона.
Титрование ИФ проводили микрометодом на пластиковых 96-луночных панелях в однодневной культур е фибр областов человека М-19. За титр ИФ принимали последнее разведение сыворотки, тормозящее на 50% развитие деструкции монослоя фибробластов вирусом энце-
Pис. 1. Хроматограмма полисахарида из Heliantnus tuberosus L.
фаломиокар дита мышей. Активность интер фе-рона в исследуемых супернатантах выражали в единицах активности (МЕ/мл) международного стандар та 1369/19, котор ый рассчитывали по национальному р ефер енц-пр епа р ату F9, изготовленному в НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Р АМН.
In vitro продукцию ИФ оценивали по количеству данного лимфокина в надосадочной жидкости 24-часовой культуры лейкоцитов кр о -ви здо р овых доно р ов под воздействием госси-пола и полисахар ида по ср авнению с контр оль-ными пр обами, где в качестве индукто р ов интер ферона использовали вирус болезни Ньюкасла и стафилококковый энтер отоксин А.
Для статистической обр аботки цифр овых экспериментальных данных использовали вариационную статистику с учетом t-критерия С тьюдента.
Противовирусная активность. Для оценки противовирусной активности полисахарида использовали модель гер петического менингоэн-цефалита мышей. И спользовали ВПГ-1, штамм Клейман, полученный из лаборатории музейных штаммов ГУ НИИ вир усологии им. Д .И. Ивановского РАМН.
Титр вир уса опр еделяли на модели фибр об-ластов эмб р ионов кур и культур е клеток Уего -инфицир ование опр еделяли по максимальному пор ажению клеток монослоя фиб р областов эмбрионов кур.
Белых мышей - группы по 30 особей -инфицировали вирусом Клеймана внутрибрю-шинно в объеме 0,2 мл с содержанием в дозе 10 и 100 ЛД50. Референц-препаратом был выбран ацикловир.
Р а створ полиса ха р ида (0,1 мг/мл) вводили в хвостовую вену за пять суток до инфицир о -вания, а также за пять суток до и через 3 ч после инфицирования. Ацикловир вводили по лечебной схеме чер ез 3, 24, 48, 72 и 96 ч после заражения. Мышам контрольной группы вво-дили физиологический р а створ.
Результаты оценивали по средней продолжительности жизни и защитному эффекту -разница показателей выживаемости в опытной и контр ольной группах.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Моносахаридный состав. Моносахаридный со
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.