БИОФИЗИКА, 2015, том 60, вып. 1, с. 109-119
= БИОФИЗИКА КЛЕТКИ =
УДК 577.3
СПЕКТРАЛЬНЫЕ ИЗМЕРЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ГЕТЕРОГЕННОСТИ КЛЕТОК И ИX ОРГАНЕЛЛ
© 2015 г. К.Б. Асланиди
Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, Пущино Московской области, ул. Институтская, 3
E-mail: kbaslanidi@gmail.сот
Поступила в p едакцию 20.10.14 г.
Методом микроспектрального анализа, позволяющим проводить оптические измерения при охлаждении вплоть до температуры жидкого азота, проведена идентификация молекулярных компонентов ряда ра стительных и животных клеток. Выявленная биохимическая гетерогенность свидетельствует о функциональной специализации отдельных клеток внутри популяции. Анализ тушения флуоресценции позволил выявить температурные области, в которых происходят процессы перекристализации внутриклеточной воды, связанной с конкретными пигмент-белковыми комплексами. П редложенный экспериментальный подход может найти применение в современной корреляционной микроскопии, а также в криобиологии для отработки оптимальных режимов замораживания и размораживания различных клеток с целью криоконсер-вации генетического материала.
Ключевые слова: криогенная микроскопия, спектр, флуоресценция, поглощение, криобиология.
В последние годы криогенная микр оскопия становится все более важным методом для создания изобр ажения, информативного как с точки зрения структуры, так и с позиции молекулярной организации клетки in vivo. Суть метода заключается в создания виртуального 3Б-изо-бражения объекта с нанометр овым разрешением поср едством объединения наборов данных, полученных разными методами криогенной микро скопии на одном объекте. Для увеличения информативности изображения разрабатываются новые криогенные методы оптической флуоресцентной микроскопии [1-4], электронной микро скопии [4-6] и томографии, использующей мягкое рентгеновское излучение [7], на одном витрифицированном биологическом образце. В последние годы широко используются именно методы быстрого замораживания ткани, поскольку они создают меньше структурных артефактов во время подготовки витрифици-рованного образца по сравнению с методами химической фиксации при комнатной температур е [8]. Флуоресцентная микро скопия кр иоген-ных образцов позволяет с помощью флуоресцирующих белков или флуоресцирующих красителей определить конкретные уникальные области, ультраструктура которых затем выявляется методами электронной микроскопии. Отметим, что качество 3D-оптического изображения определяется числом получаемых двухмерных картин, а количество изображений при
комнатной темпеpатуpе ограничено вpеменем фотодеcтpукции красителя. Пpи криогенных темпеpатуpаx выгорание обpазца пpоиcxодит значительно медленнее [4], что позволяет увеличить количество изобp ажений.
Pазвитие новых методов в значительной степени обязано также pазp аботкам мощные ком-пьютеp ов, быстрые выcокоpазpешающиx CCD-камеp, специально pазpаботанныx методов анализа, пpогp аммного обеспечения и многообразных зондов, пpедназначенныx для маpкиpовки витpифициpованныx клеток [9,10].
бедует отметить и cамоcтоятельную ценность оптичеcкиx измеpений на витрифициpо-ванные клеткаx. Анализ cпектpальных харак-теpиcтик поглощения и люминесценции отдельный клеток и иx оpганелл позволяет иденти-фициpовать опpеделенные биоxимичеcкие компоненты, а также оценить биоxимичеcкую ге-теpогенноcть отдельныx клеток в квазиодно-pодной популяции. Оcлабление энзиматичеcкиx пpоцеccов пpи оxлаждении и уcтpанение фото-xимичеcкого тушения люминеcценции должны облегчать идентификацию некотоp ыx биохими-чеcкиx компонентов клетки. Более того, тем-пеpатуpная завиcимоcть интенcивноcти люми-неcценции может являтьcя маpкеp ом xолодовыx повpеждений конкpетныx клеточныx cтpуктур.
В ранних моделях кр иомикроскопов [11-16] во избежание конденсации водяных пар ов на оптических деталях микроскопа камера с ох-
лаждаемым препаратом была изолирована от объектива микроскопа. К роме того, как сама камера, так и микроскоп помещались в жесткий бокс, заполненный сухим газом [13]. Объект охлаждался жидким азотом или его парами непоср едственно или через стенку камер ы [15]. П ри этом разность температур между объектом и микрообъективом могла достигать 200 градусов, и этот градиент локализовался на относительно толстом стекле герметической камеры и газовом зазоре между камерой и объективом [11]. С ущественным недостатком всех этих конструкций является наличие значительного расстояния между объективом и препаратом, что затрудняет применение высокоапертурных объективов. Однако только использование объективов с большой апертурой (и, как правило, малым рабочим расстоянием) позволяет регистрировать собственную люминесценцию отдельных клеток или клеточных органелл [17-21]. Это замечание относится в большей степени к животным клеткам [22-24], интенсивность собственной люминесценции которых, в отличие от фотосинтезирующих, как правило, очень низка.
Практически единственной областью применения криомикроскопов этого типа [11-13,25] было изучение процессов кристаллизации и рекристаллизации воды в биологических тканях при околонулевых температурах. Поэтому нижний предел диапазона исследуемых температур составлял несколько десятков градусов ниже нуля, использовались достаточно низкие скорости замораживания и отсутствовали возможности спектральных измерений.
Люминесцентная микроскопия при криогенных темпер атурах бурно развивается в последние годы. Е сли по результатам поиска в базе PubMed на словосочетание fluorescence microscopy в 1988 г. было найдено 726 статей, то в 2013 г. - 5575, а на словосочетание cryo microscopy в 1988 г. было найдено всего 12 статей, а в 2013 г. - уже 423. Встречаются даже вызывающе смелые публикации [26], предлагающие создание кр иомикроскопа менее чем за $40 из деталей, имеющихся в лаборатории и в про -дуктовом магазине!
Очевидно, что использование внутрилабо-раторных конструкторских возможностей для создания измерительного криомикроскопа на базе отечественных узлов и деталей будет способствовать широкому внедрению современных методов анализа структур ы и функции клетки. Целью данной статьи является описание кри-оприставки и методов измерения спектральных параметров клетки в широком диапазоне температур.
Ниже будет представлена пр остая приставка к микроспектрофлуориметр у, созданная на базе отечественных микроскопов ЛОМО и позволяющая проводить измерение спектральных ха -рактеристик поглощения и люминесценции оптическим зондом диаметр ом до 2 мкм в широком диапазоне температур, вплоть до температур ы жидкого азота. Констр укция позволяет варьировать скорости охлаждения и нагрева. Возможно также очень быстрое охлаждение (300-500 К /мин) микрообъекта поср едством заполнения камеры с препаратом жидким азотом или жидким пропаном. На широком круге объектов будет продемонстрировано, как спектральные измерения при низких температурах [17,21,27] расширяют возможности традиционных измерений при комнатной темпер атуре [1820,22-24,28-32].
ОПИ САНИЕ К РИОПРИ СТАВКИ ДЛЯ ИЗМЕРИТЕЛЬНОГО МИКРОС КОПА
Разные варианты криоприставки были созданы для отечественных микроскопов МЛД, ЛЮМАМ К-1 и ЛЮМАМ Р-8. В качестве иммерсионной жидкости при работе со стандартными объективами производства ЛОМО использовали жидкий пропан или жидкий азот. Использование жидкого азота в качестве иммерсионной жидкости уменьшает несоответствие коэффициентов преломления между образцом и линзами объектива, что ведет к более эффективному сбору света от исследуемого образца. В предлагаемой конструкции температур ный гр адиент между объектом и объективом отсутствовал, что позволяло использовать вы-сокоапертурные объективы с большим увеличением и малым рабочим расстоянием [17,21,27].
Минимизация структурных повр еждений образца достигалась за счет хорошего смачивания биологической ткани жидким пропаном, охлажденным до температуры жидкого азота. При этом происходит переход внутриклеточной воды в стекловидное состояние без кристаллизации (витрификация).
Отметим, что коэффициент преломления п составляет для жидкого пропана 1,34, для жидкого азота - 1,19, для воды - 1,33, для льда -1,313, а для воздуха - 1,00. Температура кипения пропана равна 230,9 К, что позволяет, пер ио-дически доливая жидкий азот, длительно поддерживать жидкий пропан в камере с объектом при температуре 77 К.
Отметим, что согласование показателей преломления фронтальной линзы объектива микроскопа, иммерсионной жидкости и криоген-
Рис. 1. Микрофотография двухклеточных эмбрионов мыши в жидком азоте. Быструю витрификацию проводили погружением клеток, помещенных между двумя покровными стеклами, в жидкий азот. Объектив ВИ 30 х 0,90. Препарат был любезно предоставлен Л .М. Межевикиной.
ного образца должно уменьшать светорассеяние на границе раздела сред и улучшать качество изображения. Результат использования жидкого азота в качестве иммерсионной жидкости для стандартного водноиммерсионного объектива производства ЛОМО и витрифицированного образца представлен на рис. 1.
Температурный градиент в предлагаемой конструкции возникал между объективом и корпусом микроскопа. Схема устр ойства для низкотемпературных микроспектральных исследований представлена на рис. 2.
Стандартный сухой объектив сильно рассеивает свет на границе раздела между двумя средами с различными показателями преломления, как между гидратированным биологическим образцом и воздухом, так и между воздухом и фронтальной линзой объектива. Использование криогенной иммерсионной жидко -сти с показателем преломления, соответствующим объективу, значительно снижает такие проблемы, позволяя получать флуоресцентные изображения лучше, чем при использовании высокоапертурного объектива при комнатной температуре.
И сследуемый препар ат (1) и объектив микроскопа (2) помещали в специальную термоизолирующую камеру, состоящую из кварцевого сосуда (3) объемом около 400 мл, помещенного в пенопластовый кожух (4) и заполняемого при измерениях жидким азотом, а также пенопластовой кр ышки (5), перемещающейся по ко-
Рис. 2. Схема камеры для низкотемпературных микроспект
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.