БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1995, том 21, № 2, с. 83 - 111
==========:=:== ОБЗОРНАЯ _
СТАТЬЯ
УДК 577.322.5:543.422.25
•
СПЕКТРОСКОПИЯ ЯМР В ИССЛЕДОВАНИЯХ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ СТРУКТУРЫ МЕМБРАННЫХ ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ
© 1995 г. К. В. Первушин, А. С. Арсеньев*
Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117871, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Поступила в редакцию 13.01.94 г.
В обзоре обсуждены проблемы, связанные с установлением пространственного строения мембранных пептидов и белков методом спектроскопии ЯМР высокого разрешения. Анализируются полученные этим методом данные о пространственной структуре и внутримолекулярной динамике мем-браносвязанных форм около 30 пептидов и белков, таких, как некоторые гормоны, нейропептиды, липопептиды, пептидные антибиотики, белки оболочки бактериофагов и трансмембранные участки интегральных мембранных белков. В тех случаях, когда удается подобрать адекватную искусственную среду солюбилизации (органические растворители, мицеллы детергентов или везикулы ли-пидов), спектроскопия ЯМР позволяет получать уникальную информацию о строении и динамике мембранных пептидов и белков, что является основой для исследования их структурно-функцио-нальных связей.
Ключевые слова: спектроскопия ЯМР; мембранные белки; пространственная структура белков; везикулы липидов; мицеллы детергентов.
ВВЕДЕНИЕ
Определение пространственной структуры мембранных пептидов и белков часто является наиболее критическим этапом при выяснении механизма их действия. Хотя количество белков,
Список сокращений: Aib - остаток а»аминоизомасляной кислоты, ANF - артериальный натриуретический фактор крысы, БР - бактериородопсин, GA - грамицидин A, GRP -пептид, высвобождающий гастрин, DG - дистанционный геометрический алгоритм, DM - «-додецилмальтозид, DMPC - димиристоилфосфатидилхолин, DMSO - диметил-сульфоксид, DOPE - 1-а-диолеилфосфатидилэтаноламин, DPPG - дипальмитоилфосфатидилглицерол, DPC - доде-цилфосфатидилхолин, mEGF - фактор роста клеток мыши, HMQC - двумерный спектр корреляции химических сдвигов сигналов гетероядер, НОНАНА - двумерная гомо-ядерная спектроскопия Хартмана-Хана, Hylv - остаток а-гидроксиизовалериановой кислоты, Lac - остаток молочной кислоты, LPC - лизофосфатидилхолин, LPC-SH - ли-зофосфатидилхолинсульфатид, LPE - лизофосфатидил-этаноламин, MD - молекулярная динамика, ММРС - моно-миристоилфосфатидилхолин, NOESY - двумерные (2М) спектры ЯЭО, OTG - октилтиоглюкопиранозид, PC - фос-фатидилхолин, PS - фосфатидилсерин, PLA - фосфолипа-за А2, РЕ - фосфатидилэтаноламин, Phol - остаток фенил-аланинола, RMSD - среднеквадратичное отклонение, ROESY - двумерная спектроскопия ядерного эффекта Оверхаузера во вращающейся системе координат, SDS -додецйлсульфат натрия, TRNOE - ЯМР-спектроскопия переданного ЯЭО, TOCSY - тотальная корреляционная спектроскопия, ХПЯ - химическая поляризация ядер, ЭКМ -электронная криомикроскопия, ЯМР - ядерный магнитный резонанс, ЯЭО - ядерный эффект Оверхаузера.
♦Автор для переписки - Арсеньев Александр Сергеевич (тел.: 330-59-29,330-74-83).
для которых известна последовательность аминокислотных остатков, превышает 40000, детальная пространственная структура установлена главным образом рентгеноструктурным анализом и тесно связанными с ним другими дифракционными методами всего для нескольких сотен водорастворимых белков и некоторых мембранных белковых комплексов. На данный момент неизвестна структура высокого разрешения ни для одного мембранного белка в нативном окружении. Получение детальной структурной информации существующими методами значительно затруднено, так как требует, как правило, подбора искусственной среды солюбилизации белков или получения детергент-белковых кристаллов. К настоящему времени структура всего нескольких мембранных белков известна с разрешением менее 0.2 нм. Однако эти данные позволили получить общие представления о строении мембранных белков.
Строение основных типов мембранных белков схематически показано на рис. 1. Модели (координаты атомов) пептидов и белков, как правило, представлены в различных банках данных трехмерных структур, например в Brookhaven Data Bank [1]. Обычно мембранные комплексы содержат несколько субъединиц. Мембранные белки, участвующие в преобразовании энергии клетки, состоят из субъединиц, пронизывающих мембрану, а также нескольких субъединиц, ассоциированных с поверхностью мембраны. Структура
Рис. 1. Схематическое представление строения основных типов мембранных белков (латинские и греческие буквы обозначают различные субъединицы), а- фотосинтезирующие реакционные центры, 6- лигандуправляемые ионные каналы (ацетилхолиновый рецептор), в - неселективные поры, образованные тримерами порина, г - тримеры бакте-риородопсина пурпурных мембран, д - бактериальные аспартатные рецепторы, е - трансмембранные домены некоторых бактериальных токсинов (колицин А, стрелка указывает переход между поверхностным и трансмембранным состояниями), ж - трансмембранные селективные каналы димера грамицидина А, з - неселективные ионные каналы олигомеров пептидных антибиотиков (аламетицин, мелиттин), и - а-спиральные белки оболочки филаментных бактериофагов.
двух таких комплексов была получена с разрешением 0.18 - 0.23 нм. Это фотосинтезирующие реакционные центры из двух видов бактерий, Rhodopseudomonas viridis и Rhodobacter sphaero-ides [2], кристаллизованные в виде белок-детер-гентного комплекса с детергентом N.N-диметил-додециламин-1Ч-оксидом. Фотосинтезирующий реакционный центр Rh. viridis (см. рис. 1а) состоит из 4 субъединиц (Н, L, М и С). Субъединицы L и М содержат по 5 трансмембранных а-спираль-ных участков, атом железа и пигментные кофакторы, субъединица Н пронизывает мембрану одной трансмембранной а-спиральго. Цитохром с (субъединица С) не содержит трансмембранных участков и связан с субъединицами L и М на экзо-плазматической стороне мембраны.
Лигандуправляемые ионные каналы состоят обычно из нескольких сходных субъединиц, имеющих трансмембранные а-спиральные участки и области, значительно выступающие над поверхностью мембраны. Например, ацетилхолиновый рецептор, структура которого получена с очень низким разрешением, порядка 2.0 нм [3], состоит из 5 сходных субъединиц (o^ßyS), каждая из которых проникает через мембрану, выступая из нее более чем на 2.0 нм (рис. 16).
Матричный порин является примером мембранного белка, почти полностью погруженного в мембрану, имеющего в отличие от других мембранных белков вторичную структуру типа ß-лис-та [4]. Комплексы такого типа, образующие неселективные поры, состоят, как правило, из нескольких идентичных субъединиц (рис. 1в).
Светоулавливающие белки, такие, как бакте-риородопсин и хлорофилл-белковый комплекс II гороха, также имеют олигомерную структуру, состоящую из идентичных или почти идентичных субъединиц (рис. 1г). Их структура получена [5,6] с использованием методов электронной криоми-
кроскопии (ЭКМ) с разрешением 0.35 нм в направлении поверхности мембраны и 1.0 нм в перпендикулярном направлении. Достигнутое разрешение позволило построить модель молекулы бактериородопсина, передающую лишь общие мотивы укладки основной цепи [5].
Некоторые мембранные белки имеют значительный по размерам функциональный домен, заякоренный на мембране одной трансмембранной а-спиралыо (рис. 1<3). После протеолитиче-ского отщепления трансмембранного участка функциональный домен удается закристаллизовать в высокоупорядоченные кристаллы. Таким путем была исследована пространственная структура бактериального аспартатного рецептора [7], антигена НЬА-А2 гистосовместимости [8] и некоторых другие мембранных белков (см. для обзора [9]).
Особый класс мембранных белков представляют некоторые бактериальные токсины, являющиеся водорастворимыми белками, образующими при связывании с мембраной гидрофильные поры. К настоящему времени установлена с разрешением порядка 0.25 нм пространственная структура трансмембранных доменов четырех токсинов в водорастворимой форме - колицина А [10], 5-эн-дотоксина [11], дифтерийного токсина [12] и экзотоксина А [13] (рис. 1е).
Некоторые пептидные антибиотики образуют трансмембранные селективные (грамицидин А) и неселективные (аламетицин, мелиттин) ионные каналы, как правило в димерном или олигомерном состоянии (рис. 1 ж, з). После кристаллизации из органических растворителей были получены высоко-упорядоченные кристаллы и установлена пространственная структура грамицидина А [14], аламе-тицина [15] и мелиттина [16]. Однако полученная структура грамицидина А, так называемая форма 3, не соответствует конформации ионного канала.
Особый случай представляют а-спиральные белки оболочки филаментных бактериофагов (рис. 1м), образующие трансмембранные тяжи при атаке мембраны бактерий вирусом [17 - 19].
Лимитирующая стадия при использовании методов рентгеновской и/или электронной микроскопии в исследовании структуры мембранных белков - их кристаллизация [20]. Обычно для этой цели используют различные типы детергентов, представляющих собой водорастворимые амфифильные молекулы с массой 200 - 650 Да и содержащих гидрофильную головку и гидрофобный хвост [21]. В зависимости от химического строения детергенты делятся на неионные и заряженные. В воде при концентрации выше некоторой критической детергенты образуют мицеллы в виде сферических или вытянутых частиц, содержащих 30 - 200 молекул. Характеристики мицелл сильно зависят от природы детергента. При включении молекулы белка в мицеллу, как правило, не происходит изменения количества молекул детергента в мицелле. По-видимому, солюби-лизация белков из мембраны с помощью детергентов является наиболее надежным путем получения высокоупорядоченных кристаллов. Солюбилизация в органических растворителях приводит, как правило, к полной или частичной денатурации мембранных белков, что в конечном итоге препятствует образованию правильных кристаллов [20].
Спектроскопия ЯМР высокого разрешения твердого тела позволяет получать структурную информацию для белков как в кристаллическом, так и в порошкообразном состоянии, а также для белков, иммобилизован
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.