ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2011, том 438, № 6, с. 834-837
= ФИЗИОЛОГИЯ
УДК 612.015:616.65-006.6-07
СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ИЗОФОРМЫ ПЛАЗМИНОГЕНА ПРИ РАЗВИТИИ РАКА ПРОСТАТЫ У ЧЕЛОВЕКА
© 2011 г. Д. И. Водолажский, Е. Ф. Шин, А. Ю. Голиков, Т. Н. Белова, Д. В. Зимаков, Е. Н. Черкасова, Н. В. Бойко, М. И. Коган, М. Б. Чибичян, С. А. Мошковский, член-корреспондент РАН Д. Г. Матишов
Поступило 11.02.2011 г.
Впервые при анализе изоформ молекулы плаз-миногена, отличающихся молекулярной массой (М^) и изоэлектрической точкой (р1), обнаружены специфические варианты изоформ, которые встречаются в плазме крови больных с гистологически верифицированным локальным и распространенным раком простаты в 55% и 70% случаев соответственно. Интерес к исследованию плаз-миногена в значительной степени обусловлен тем, что на его основе в клетках формируются белковые продукты, которые играют существенную роль в развитии злокачественных опухолей [1, 2]. После трансляции молекула плазминогена, состоящая из 810 аминокислотных остатков, претерпевает ряд посттрансляционных модификаций. В результате протеолитического расщепления первых 19 аминокислотных остатков с М-тер-минального конца формируется глутаминовая форма плазминогена (С1и-плазминоген), которая является предшественником плазмина и ан-гиостатина. В случае образования плазмина от молекулы С1и-плазминоген с М-конца отщепляется пептид, состоящий из 77 аминокислот, а оставшаяся полипептидная последовательность протеолитически расщепляется в положении 580—581. В результате образуются тяжелая цепь, состоящая из активационного пептида и 5 кринглов, и легкая цепь, в которой расположен активный центр (Гис603, Асп646, Сер741), отвечающий за протеолитическую активность. В процессе образования плазмина участвуют обе эти цепи, соединенные между собой дисульфидными мостиками [3]. Плазмин стимулирует ангиогенез и усиливает опухолевую инвазию. С другой стороны, ангио-статин, представляющий собой фрагмент плазминогена, содержащий первые 4 крингла тяжелой цепи (положения от 79 до 466 АК) и имеющий
Институт аридных зон Южного научного центра Российской Академии наук, Ростов-на-Дону Ростовский государственный медицинский университет Институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича Российской академии медицинских наук, Москва
MW 38 кДа, является известным ингибитором ан-гиогенеза [4]. Таким образом, эти два белковый продукта выступают в качестве функциональный антагонистов при протекании ангиогенеза [5].
В настоящее время до конца не ясны механизмы регуляции процессов посттрансляционных модификаций молекулы плазминогена, в результате которых происходит формирование этих двух производных плазминогена. В частности, остается невыясненной роль различных изоформ плазминогена при протекании процессов, играющих заметную роль при "озлокачествлении" опухолевый клеток. Существование различный изоформ плазминогена описано давно [6], однако в литературе отсутствуют данные о связи отдель-ныгх изоформ плазминогена с развитием злокачественный опухолей человека.
Цель нашего исследования заключалась в изучении спектра изоформ плазминогена на разный стадиях развития опухолевого процесса в предстательной железе у человека.
Образцы периферической крови были взяты у пациентов (мужчин) в возрасте от 61 до 70 лет: 10 условно здоровый доноров — контроль, 11 пациентов — локальный рак простаты (стадия Т1-2, ЛР), 10 пациентов — распространенный рак простаты (стадия Т3-4, РР). Все участники исследования быши полностью информированы и документально выразили свое согласие на участие в эксперименте. Препаративное выщеление плазми-ногена из плазмы крови осуществляли с помощью аффинной хроматографии по модифицированному методу Мерца, который основан на использовании аффинного сорбента лизин-сефарозы, специально связывающего белки, содержащие крингловые домены [7]. Двумерное электрофоре-тическое разделение изоформ плазминогена проводили в полиакриламидном геле ("Bio-Rad", США). Визуализацию белков осуществляли посредством окрашивания азотнокислым серебром [8]. Сравнительный анализ белков на геле проводили с использованием программы PDQuest, версия 7.4.0 ("Bio-Rad", США), идентификацию изоформ плазминогена проводили с применени-
СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ИЗОФОРМЫ ПЛАЗМИНОГЕНА
835
Рис. 1. Схема проведения эксперимента.
ем метода масс-спектрометрии (Autoflex II MAL-DI-ToF ("Bruker Daltonics", Германия) и масс-спектрометра с ионной ловушкой LCQ Deca XP МАХ ("Thermo", США)) с поиском в швейцарской базе данных Swiss-prot пporpaммы Mascot Search, версии 2.2.06. При оценке статистически значимых различий между частотой возникновения отдельных изоформ плазминогена в контроле и в опытных образцах использовался метод х2. Исследование динамики изменений спектра изо-форм плазминогена в зависимости от стадии развития новообразования в простате проводили с помощью дискриминантного анализа в соответствующих модулях пакета программы Statistica 7.0.
Процесс выделения и идентификации различных изоформ плазминогена, выделенных из плазмы крови пациентов с гистологически верифицированным локальным и распространенным раком простаты, включал в себя 3 последовательных этапа (рис. 1). На первом этапе с использованием хроматографии с аффинным сорбентом были выделены из тотальной смеси белков плазмы крови пациентов с локальным и распространенным раком простаты варианты белков, структура которых содержала крингловые домены.
После специфической элюции белки, которые связались с лигандом, подвергали электрофоре-тическому разделению в двумерном полиакрила-мидном геле (рис. 2). Зарегистрированные белковые продукты различались как по MW, так и значением pI. При использовании двух методов масс-спектрометрии было показано, что наблюдаемые на двумерном электрофорезе спектры белков представлены различными изоформами плазминогена.
В качестве примера на рис. 2 представлены результаты электрофоретического разделения изоформ плазминогена пациента с выявленным локальным раком предстательной железы.
На рис. 3 представлены усредненные спектры изоформ плазминогена, полученные с помощью программы РЭРие81, для каждой из рассматриваемых нами категорий лиц с различными формами патологии простаты. В контрольной и опытных группах исследуемых индивидуумов
обнаружено 16 изоформ плазминогена (П-1— П-16), различающихся по MW и р1. Как в контрольной группе, так и в группе с ЛР и РР по MW наблюдали изоформы плазминогена, разделенные на три категории: 116, 114 и 112 кДа соответственно. В свою очередь изоформы, принадлежащие к каждой из этих групп, различались значением р1. Анализ спектров изоформ плазминогена в опытных группах по сравнению с контролем показал, что наблюдаемые профили от П-1 до П-11 присутствовали во всех исследуемых случаях, независимо от того, относились они к контрольной группе или к группе больных. Различия касались группы спектров изоформ от П-12 до П-16 (табл. 1).
Проведенные расчеты показали, что значимые различия мы наблюдали для всех учитываемых изоформ в случае РР и изоформ П-14 и П-15 — для группы ЛР. Для изоформы П-13 различия в частоте встречаемости у лиц, относящихся к группе ЛР, по сравнению с контролем оказались статистически незначимыми.
Использование дискриминантного анализа позволило рассмотреть динамику изменения спектра изоформ плазминогена в зависимости от
836
ВОДОЛАЖСКИЙ и др.
П-1 П-2 П-3 П-4П-5 П-6
K I
I П-8 |п-1о' П7 П-9 П-11П-12
ЛР
П-1 П-2 П-3П-4 П-5П-6
I
П-13
П-14
I I
П-15
П-8 П-1о П-11 П-7 П-9 П 11П-12
РР П-1 П-2 П-3 П-4 П-5 П-6
I I I I II
П-13
П-14 П-16 П-15
П
П-7 П-8 П-9 П-1о
П-11
_I_I_I_I_I_I_I_I_
6.5 7.0 7.1 7.5 7.6 7.7 7.8 8.0 pH
Рис. 3. Усредненный спектр изоформ плазминогена (К — контроль, ЛР — локальный рак простаты, РР — распространенный рак простаты).
стадии развития новообразования в простате. Результаты этого анализа представлены в табл. 2.
Проведенный анализ показал, что использование в качестве индикаторов стадии развития опухолей простаты спектра изоформ плазминогена
позволяет с высокой вероятностью идентифицировать распространенный и локальный рак в 70% и 55% случаев соответственно в анализируемой выборке исследуемых случаев. Из табл. 2 видно, что спектры изоформ (№ 3, 4, 5, 6, 7) — для ЛР и спектры изоформ (№ 8, 10, 11, 12) — для РР явля-
Таблица 1. Оценка значимости различий изоформ плазминогена МW 112 кДа в опытных группах по сравнению с контрольной
Номер изоформы К ЛР РР
pI п п х2 Р n х2 Р
+ - + - + -
П-12 7.68 6 4 5 6 0.05 0.82 0 10 5.95 0.015
П-13 7.71 0 10 3 8 1.34 0.25 7 3 7.91 0.005
П-14 7.73 0 10 5 6 3.72 0.05 7 3 7.91 0.005
П-15 7.78 0 10 5 6 3.72 0.05 5 5 4.27 0.039
П-16 7.85 0 10 0 11 - - 6 4 5.95 0.015
Примечание. Плюс — присутствие изоформы, минус — отсутствие ее. п — число пациентов с наличием или отсутствием соответствующих изоформ.
СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ИЗОФОРМЫ ПЛАЗМИНОГЕНА
837
Таблица 2. Прогностическая эффективность спектра изоформ плазминогена при развитии новообразования простаты
№ спектра
П-12
Спектр изоформ
П-13
П-14
П-15
П-16
Распределение апостериорных вероятностей
К ЛР РР
6 0.84 0.16 0.001
4 0.52 0.41 0.069
1 0.065 0.93 0.008
3 0.52 0.41 0.069
2 0.84 0.16 0.001
1 0.25 0.74 0.005
1 0.057 0.93 0.010
2 0.065 0.93 0.008
1 0.016 0.98 0.000
1 2
3 2 1
4
5
6 7
+
+
+
+
Контроль
Локальный рак
+
Распространненый рак
8 - + + + + 4 0.000 0.001 0.999
9 - + + + - 1 0.012 0.701 0.286
10 - + + - + 1 0.000 0.000 1.000
11 - + - - - 1 0.009 0.006 0.985
12 - - + - + 1 0.027 0.027 0.946
2 - - - - - 2 0.52 0.41 0.069
Примечание. Под спектром подразумеваем комбинацию указанных изоформ П-12—П-16. Плюс, минус — присутствие, отсутствие изоформ, п — число пациентов. Распределение апостериорных вероятностей указано в долях от единицы. Полужирным штрифтом выделены правильно идентифицированные специфические спектры изоформ.
n
ются специфическими (выделены полужирным штрифтом). При этом значимость прогноза меняется при переходе одного спектра изоформ к другому, а также зависит от типа учитываемой патологии. Таким образом, полученн
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.