БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2015, том 32, № 1, с. 11-19
УДК 577.352
СПЕЦИФИКА ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНОГО ПРОТОНОФОРА 2,4,6-ТРИХЛОР-3-ПЕНТАДЕЦИЛФЕНОЛА С ИСКУССТВЕННЫМИ И МИТОХОНДРИАЛЬНЫМИ МЕМБРАНАМИ © 2015 г. Д. Б. Джумашев1, И. М. Бывшев2, С. А. Еремеев3, Л. С. Ягужинский2, 3*
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, факультет биоинженерии и биоинформатики,
119991, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 73 2Московский физико-технический институт (Государственный университет), факультет общей и прикладной физики, 141700, Долгопрудный Московской обл., Институтский пер., 9 3Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Научно-исследовательский инстиут физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, 119991, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 40;
*электронная почта: yag@genebee.msu.su Поступила в редакцию 10.07.2014 г.
Работа посвящена расширенному изучению мембранотропных свойств поверхностно-активного реагента — 2,4,6-трихлор-3-пентадецилфенола (ТХФ-С15), который в предыдущих исследованиях проявил себя как разобщитель окислительного фосфорилирования, избирательно взаимодействующий с формирующейся в условиях работы Н+-насосов фракцией неравновесно связанных протонов на поверхности мембран митохондрий. Получено дополнительное подтверждение выводов предыдущих исследований на модифицированном препарате митохондрий печени, которые при работе протонных насосов не формируют фракции мембраносвязанных Н+-ионов, обладающих избытком свободной энергии. При этом показано, что ТХФ-С15 не обладает разобщающей активностью на нестандартном препарате митохондрий. Доказано, что ТХФ-С15 связывается с поверхностью мембран в отрицательно заряженной форме. На модели БЛМ было установлено, что ТХФ-С15 в определенных условиях обладает свойствами классических трансмембранных переносчиков Н+-ионов. Найдены условия, при которых циклический процесс трансмембранного переноса ионов водорода в электрическом поле, протекающий с участием этого протонофора, лимитирован не скоростью реакции отрыва протона от поверхности мембраны, но, напротив, скоростью реакции присоединения протона к аниону поверхностно-активного разобщителя, протекающей на межфазной границе мембрана-вода; предложена полная схема этого процесса.
Ключевые слова: митохондрии, протонные насосы, неравновесно связанные ионы водорода, связывание протона на межфазных границах.
Б01: 10.7868/80233475515010041
ВВЕДЕНИЕ
Работа посвящена изучению механизмов транспорта энергии окислительных реакций в митохондриях, которые определяют работу системы сопряжения процессов электронного транспорта с транспортом ионов водорода при функционировании фосфорилирующей системы митохондрий, и изучению этих процессов в модельных реакциях. В настоящее время общепринятым считается механизм, предложенный П. Митчеллом, который включает трансмембранный перенос Н+ в качестве первой стадии запасания энергии окислительных реакций [1]. В настоящее время интенсивно исследуется альтернативный механизм, предложенный Р. Вильямсом, в основе которого лежит прямая (локальная) передача энергоноси-
телей — ионов водорода — от дыхательных протонных насосов на АТР-синтазу в составе суперкомплекса, включающего электрон-транспортную и АТР-синтазную системы [2].
В предыдущих работах [3, 4] нами было доказано, что в условиях работы протонных насосов на поверхности мембран митопластов [5] и митохондрий [6] формируется метастабильная фракция ионов водорода, обладающих избытком свободной энергии. Мембраносвязанные протоны находятся в неравновесном состоянии и участвуют в реакции синтеза АТР [3, 4]. Спонтанный отрыв этих ионов от мембраны в объем водной фазы протекает относительно медленно [7—9]. Впервые формирование метастабильной фракции Н+-ионов, связанных с мембраной, было обнару-
жено в работе [10] на родопсиновых бляшках. На БЛМ нами была создана искусственная модельная система, в которой трансмембранный перенос ионов водорода лимитирован реакцией отрыва протона от транс-поверхности мембраны, и при этом на транс-поверхности мембраны регистрируется эффект накопления мембраносвязан-ных ионов водорода, обладающих избытком свободной энергии [7]. Обнаруженный эффект показал, что в процессе переноса протона через гидрофобный барьер липидного бислоя должна протекать реакция частичной дегидратации протона (и его переносчика). По существу в этой работе показано, что энергия ионов водорода может запасаться в форме связанных с мембраной частично дегидратированных протонов. В этих опытах были обнаружены также катализаторы, ускоряющие реакцию отрыва Н+-ионов от поверхности мембраны. Было показано, что в условиях трансмембранного переноса протона через БЛМ катализатор анион лимонной кислоты (цитрат) ускоряет трансмембранный поток протонов и одновременно снижает поверхностный заряд мембраны, который измерялся методом компенсации внутреннего поля [7]. В ответ на повышение концентрации непроникающих катализаторов (цитрата или ИЕРЕ8) происходит снижение рН в непере-мешиваемом примембранном слое на транс-стороне БЛМ. Этот эксперимент показал, что непроникающие "катализаторы-буферы" (цитрат или ИЕРЕ8), которые увеличивают скорость отрыва протона от мембраны, ускоряя тем самым трансмембранный перенос Н+-ионов, вызывают за-кисление примембранного водного слоя, т.е. вызывают эффект, противоположный по знаку тому, который должен был бы наблюдаться при повышении буферной емкости в экспериментальной ячейке. Это наблюдение однозначно показало, что в условиях экспериментов, проведенных в работе [7], слабые не проникающие через мембрану основания, обладающие свойствами буферов, реально выполняют роль катализаторов реакции диссоциации мембраносвязанных кислот Брен-стеда, протекающей в процессе отрыва протона от поверхности бислоя. Качественно аналогичные результаты получены на митопластах [5]. В этой статье было установлено, что включение работы Н+-насосов снижает отрицательный ^-по-тенциал, и катализатор (ИЕРЕ8) обращает этот эффект. В работе [3] было показано также, что на митохондриях катализатор (ИЕРЕ8 20 мМ) значительно повышает максимальную величину трансмембранного потока И+-ионов [3]. Недавно в нашей лаборатории был синтезирован и частично изучен 2,4,6-трихлор-3-пентадецилфенол (ТХФ-С15) [8, 9]. В отличие от известных классических протонофоров это соединение является поверхностно-активным веществом, обладающим очень высоким сродством к межфазной гра-
нице мембрана—вода. Такой протонофор эффективно связывается с поверхностью мембран митохондрий; его растворимость в мембране благодаря присутствию большого гидрофобного радикала на 6—7 порядков выше растворимости в воде. Эффективное связывание ТХФ-С15 происходит в зоне межфазной границы мембрана-вода, где локализована фракция неравновесно связанных с мембраной ионов водорода. Это соединение в условиях, при которых наблюдается образование фракции мембраносвязанных ионов водорода, проявляет себя как разобщитель, стимулирующий дыхание митохондрий в состоянии 2 по Чансу. Эти результаты были воспроизведены нами (см. рис. 1а, б) на стандартных образцах митохондрий. Показано, что катализатор (ИЕРЕ8 20 мМ), удаляющий фракцию неравновесно связанных ионов водорода, практически полностью блокирует разобщающее действие поверхностно-активного разобщителя.
Важно, что фосфат, который, как известно, транспортируется в митохондрии в симпорте с протоном [11] (с участием специфического переносчика), также блокирует эффект разобщения, индуцированный поверхностно-активным прото-нофором ТХФ-С15. Внесение ингибитора фосфатного переносчика — ^этилмалеимида ^ЕМ) — в суспензию митохондрий восстанавливает разобщающий эффект поверхностно-активного фенола ТХФ-С15 [8].
В представленной работе показано, что на модифицированных препаратах митохондрий, не формирующих фракции Н+-ионов, обладающих избытком свободной энергии, ТХФ-С15 не проявляет свойств разобщителя. Тем самым была проведена дополнительная проверка полученных ранее выводов.
Основная часть работы посвящена исследованию мембранотропных свойств ТХФ-С15 на двух модельных системах — на БЛМ и липосомах. Эти опыты выявили специфические свойства ТХФ-С15 как поверхностно-активного протонофора. Были найдены условия, при которых поверхностно-активный протонофор ТХФ-С15 стабилизирует процесс неравновесного связывания ионов водорода на плоской мембране. Это наблюдение составляет наиболее важный результат данного исследования.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Синтез 2,4,6-трихлор-3-пентадецилфенола (ТХФ-С15). ТХФ-С15 был синтезирован путем хлорирования 3-пентадецилфенола в условиях интенсивного освещения. Строение продукта синтеза подтверждено методом протонно-маг-нитного резонанса (ПМР); подробное описание
Сукцинат Сукцинат
Рис. 1. Стандартные препараты митохондрий. При работе дыхательных Н+-насосов происходит формирование фракции неравновесно связанных ионов водорода. Низкие концентрации ТХФ-С15 эффективно стимулируют дыхание митохондрий в состоянии 2 по Чансу, субстрат — сукцинат, добавлен ротенон (1 мкМ). а — Катализатор реакции отрыва мембраносвязанных протонов (НЕРЕ8 20 мМ) практически полностью подавляет эффект стимуляции дыхания, индуцированный протонофором ТХФ-С15. б — Подавление разобщающего действия ТХФ-С15 добавлением фосфата (2 мМ). Ингибитор фосфатного переносчика ^этилмалеимид (ЫБМ) обращает эффект фосфата [8]. Числа в конечной части полярограмм соответствуют степени ускорения исходного дыхания, принятого за 1, под действием ТХФ-С15.
метода синтеза и ПМР-спектра приведено в работе [9].
Выделение митохондрий из клеток печени крыс.
В процессе выделения митохондрий использовали среду выделения митохондрий, содержащую 210 мМ маннитола, 40 мМ сахарозы, 5 мМ HEPES, 0.5 мМ EDTA, 100 мг БСА/100 мл, среду промывки митохондрий, не содержащую БСА, и среду инкубации митохондрий (гипотония, 120 мОсм): 3 мМ HEPES, 90.5 мМ маннитола, 0.25 мМ EDTA, 1 мМ MgCl2 ■ 6H2O, 13 мМ KCl (все с рН 7.4). Митохондрии из печени крысы получали по методике дифференциального центрифугирования [12].
Среда для выделения митопластов содержала 200 мМ маннитола, 40 м
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.