МИКРОБИОЛОГИЯ, 2013, том 82, № 4, с. 448-455
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 631.46.579.832.4.083.12(470-252.62)
зрнозоыа хуюгава эр. поу. - ОЛИГОТРОФНАЯ ПЛЕОМОРФНАЯ БАКТЕРИЯ МИКО-БАКТЕРИАЛЬНОГО СООБЩЕСТВА
ПРЕСНОВОДНЫХ ЭКОСИСТЕМ © 2013 г. М. В. Зайчикова*,1, Ю. Ю. Берестовская*, Б. Б. Кузнецов**, Л. В. Васильева*
* Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук, Москва ** Центр "Биоинженерия" Российской академии наук, Москва Поступила в редакцию 01.10.2012 г.
Новая аэробная бактерия, штамм /-0088, в соответствии с данными 168 РНК-анализа отнесенная к роду 8р1го$ота, была выделена из умеренно кислой (рН 5.0) дистрофной слабо гумифицированной воды, сформированной ксилотрофными грибами в процессе деградации древесины ели. Клетки штамма представляют собой неподвижные, грамотрицательные, прямые или изогнутые палочки размером 0.5—1.5 х 1—6 мкм, также могут иметь тороидальную форму. Клетки обычно одиночные, но могут образовывать спирально закрученные нити с разным количеством завитков: 4—13. Размножаются делением. Штамм /-0088 является органогетеротрофом и использует в качестве органических субстратов для роста ксилан, инулин, ксилозу, сахарозу, М-ацетилглюкозамин. Бактерия является олиготрофным организмом, оптимальная концентрация субстрата в среде составляет 0.5 г/л. Организм чувствителен к содержанию №С1 в среде: концентрация выше 1% в среде полностью подавляла рост клеток. Организм растет в интервале рН 3.8—7.5 с оптимумом рН 5.5—6.5. Температурные пределы роста 13—35°С, оптимум при 28°С. Содержание Г + Ц в ДНК составляет 50.2 мол. %. Экофизиологические особенности штамма /-0088: олиготрофия, мезофилия, умеренная ацидофилия, чувствительность к №С1, характеризуют его как представителя группы омброфильных дисси-потрофов. Штамм отнесен к новому виду 8р1го$ота \ylofaga 8р. поу.
Ключевые слова: ксилотрофное сообщество, олиготрофные бактерии, диссипотрофы, дистрофные воды, ацидотолерантность, Spirosoma xylofaga sp. nov.
DOI: 10.7868/S0026365613040150
Бактерия со специфической морфологией, клетки которой имели кольцевидную или подковообразную форму, была впервые выделена в 1887 г. [1]. Организм был описан в 1894 г. как Spirosoma Migula, но впоследствии был утерян. Огранизм с такими свойствами был вновь выделен и описан в 1978 г. [2] В 1984 г. род Spirosoma был отнесен к семейству Spirosomaceae [3]. Семейство Spirosoma-ceae включало в себя 4 рода: Spirosoma, Flectobacil-lus, Runella и Cyclobacterium [3]. В настоящее время род Spirosoma входит в состав семейства Flexibac-teriaceae (порядок Sphingobacteriales, класс Sphin-gobacteria, тип Bacteroidetes), наряду с родами Flectobacillus, Runella, Flexibacter, Meniscus, Mi-croscilla, Sporocytophaga, Dyadobacter, Hymeno-bacter, Cytophaga и Cyclobacterium [4]. Все представители рода Spirosoma являются типичными са-протрофами, обитателями воды и ила пресных водоемов, реже встречаются в почвах.
1 Автор для корреспонденции (e-mail: marinaz15@yandex.ru).
Целью настоящей работы было изучение эко-физиологических особенностей и описание штамма /-0088 — представителя бактериального сообщества дистрофной слабо гумифицирован-ной воды и установление таксономического положения нового организма.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объект исследования и источник выделения.
Штамм /-0088 был выделен из дистрофной умеренно кислой (рН 5.0) воды микролизиметра, в котором происходило разложение древесины ели ксилотрофным сообществом грибов [5].
Состав среды и условия культивирования.
Штамм /-0088 был выделен на минеральной среде, которая содержала 5 мл/л солей Хатнера в качестве минеральной основы [5], 10 мл/л культу-ральной жидкости после роста грибов и 0.05 г/л дрожжевого экстракта в качестве фактора роста. Культуральную жидкость получали после роста
грибов Aspergillus ustus, Trichoderma harzianum, Cladosporium sp., Penicillium sp., Paecilomyces sp. на минеральной среде Чапека с ксилозой в качестве субстрата (2 г/л). Штамм Z-0088 был выделен в чистую культуру из образца дистрофной воды путем многократных пересевов на агаризованную среду (2% агара). Для подавления роста грибов использовали нистатин (500 тыс. ед./л).
Чистую культуру поддерживали в жидкой среде ХКД, содержащей 20 мл/л раствора солей Хат-нера, смесь витаминов [5], 0.5 г/л ксилозу в качестве субстрата, 0.01 г/л дрожжевой экстракт. Электропроводность среды составляла 930 мкСм.
Микроскопические исследования. Морфологию клеток изучали в световом микроскопе с фазовым контрастом Amplival ("Carl Zeiss", Германия), а также электронном микроскопе JEM-100C ("JEOL', Япония). Для электронной микроскопии использовали негативно-окрашенные препараты клеток. Клетки контрастировали 1% раствором уранил-ацетата. Для получения ультратонких срезов клетки предварительно фиксировали глутаровым альдегидом с последующей дофиксацией осмиевой кислотой на какодилатном буфере. Образцы заключали в эпоксидные смолы. Ультратонкие срезы получали на ультратоме LKB ("BROMMA", Швеция) и окрашивали цитратом свинца с докрашиванием 3% водным раствором уранилацетата.
Определение экофизиологических характеристик. В качестве субстратов, используемых микроорганизмом, были исследованы: сахара — арабиноза, ксилоза, глюкоза, фруктоза, галактоза, манноза, лактоза, мальтоза, сахароза, раффиноза, ксилан, целлобиоза, рамноза, трегалоза; спирты — арабит, глицерин, сорбит, маннит; соли органических кислот — формиат, ацетат, бутират, пропионат, пируват, фумарат, сукцинат, оксалат, оксалоацетат, цитрат, малат, бензоат; первичные спирты — метанол, этанол; аминокислоты — метилаланин, глутамат, лейцин, цистеин, аспартат; метиламины.
Рост бактерии оценивали по изменению оптической плотности (ОП600) клеточной суспензии на спектрофотометре UNICO 2100 ("UNICO", США) и по интенсивности дыхания. Интенсивность дыхания определяли по изменению количества углекислого газа в экспериментальных флаконах с использованием инфракрасного СО2-анализатора INFRALIT-4 ("GUNKALOR-DESAU", Германия).
Диапазон рН роста микроорганизма исследовали в интервале значений 3.0—8.0: рН в пределах значений 3.0—4.8 получали, подкисляя основную среду 0.1 N раствором HCl; значения 4.8—8.0 получали, добавляя 0.05 М растворы Na2HPO4 и KH2PO4; рН измеряли на рН-метре-иономере Эксперт 001 ("Эконикс-эксперт", Россия).
Температурные пределы роста бактерии изучали в интервале 2—42°С.
Зависимость роста выделенной бактерии от содержания NaCl в среде исследовали в пределах концентраций 0.2—30.0 г/л.
Электропроводность среды измеряли кондуктометром HI 8733 ("HANNA instrument Srl.", Италия).
Принадлежность пигмента штамма Z-0088 к группе каротиноидов или ксантофиллов определяли в соответствии с методом [6, 7].
О наличии каталазной активности судили по образованию пузырьков кислорода при воздействии на клетки 3% раствором перекиси водорода. Наличие оксидазы определяли по изменению цвета колонии с реагентом REF—55635 ("bioMerieux", Франция).
Определение потребности в витаминах определяли на среде ХКД, содержащей смесь витаминов [5]. Контролем являлась аналогичная среда без витаминов.
Для определения состава жирных кислот в ли-пидах бактерию выращивали в оптимальных для нее условиях. Отбор биомассы для анализа проводили в фазе экспоненциального роста. Состав жирных кислот (ЖК) в липидах определяли на хроматографе (Microbial Identification System (Sherlok), "MIDI Inc.", Newark, США) в соответствии с методикой [8]. Идентификацию разделенных ЖК проводили по их масс-спектрам на приборе AT-5971 SMART ("Agilent Technologies").
Устойчивость к антибиотикам определяли при помощи тестовых дисков ("Becton Dickinson and Company", США).
Молекулярно-генетические исследования. Для экстракции ДНК применяли модифицированный метод щелочного выделения ДНК Бирнбой-ма-Доли [9] и Wizard-технологии ("Promega", США). ПЦР-амплификацию фрагментов гена 16S рРНК проводили с использованием универсальной системы праймеров [10]. Для амплификации полноразмерной копии гена 16S рРНК использовали пару праймеров (8-27f)-1492r. Секве-нирование продуктов амплификации проводили по методу Сэнгера [11] с помощью набора реактивов Big Dye Terminator v.3.1 ("Applied Biosystems Inc.", США) на анализаторе ABI PRIZM 3730 ("Applied Biosystems Inc.", США) согласно инструкциям производителя. Первичный сравнительный анализ полученых de novo последовательностей с последовательностями базы данных GenBank проводили с помощью программы NCBI Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ blast). Редактирование последовательностей проводили с помощью редактора BioEdit (http:// jwbrown.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html). Построение бескорневых филогенетических деревьев исследуемых бактерий производили с помощью методов, реализованных в пакете программ TREECON [12].
) ^ 1 С» с /• О и (а) ¿ъ (б) 5 мкм | |
(в) гГ> А ШЬул Л У V с^ г (г) 5 мкм | |
Рис. 1. Микрофотографии клеток штамма Z-0088, фазовый контраст.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Морфология и тонкое строение. При оптимальных условиях культивирования клетки штамма Z-0088 имеют подковообразную или тороидальную форму, одиночные или в парах (рис. 1а, 1б; рис. 2а, 2б), неподвижные, размером 0.5—1.5 х 1—6 мкм. Могут формировать 8-образные парные образования (рис. 2а) или спирально закрученные нити с длиной спирали 30—40 мкм (рис. 1в, 1г). Обладают слизистой капсулой. Бактерии размножаются делением. Спор не образуют. Ультратонкие срезы клеток штамма Z-0088 показали, что клеточная
стенка имеет строение, свойственное грамотри-цательным бактериям (рис. 2в). Морфология выделенного микроорганизма характерна для всех представителей рода Бр1го5оша (табл. 1).
Культуральные свойства. На десятые сутки роста на агаризованной среде ХКД штамм Z-0088 образовывал непрозрачные ярко-желтые колонии 4—5 мм в диаметре, слизистые, вязкой консистенции. Колонии имели округлую форму, ровный край, плоский профиль.
Физиологические свойства. Бактерия является облигатно аэробной и мезофильной, она росла в
Рис. 2. Электронная микрофотография (а, б) и ультратонкое строение (в) клеток Spirosoma 8р. Z-0088.
пределах температур 13—
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.