ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 51, № 5, с. 495-501
УДК 663.15:577.15/.17
СПИРТОВЫЕ ДРОЖЖИ -ПРОДУЦЕНТЫ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ ПЕПТИДОВ
© 2015 г. Е. В. Клячко, Е. В. Морозкина, Б. Ц. Зайчик, С. В. Беневоленский
Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, Москва 119071 e-mail: eklyachko@yandex.ru Поступила в редакцию 26.03.2015 г.
Созданы штаммы спиртовых дрожжей, синтезирующие пептиды, подавляющие рост молочнокислых бактерий Lactobacillus sakei, Pediacoccuspentasaceus, Pediacoccus acidilactici и др., которые могут быть использованы при производстве этанола для борьбы с заражением молочнокислыми бактериями. Синтезированы гены, кодирующие антибактериальные пептиды педиоцин и плантарицин, с предпочтительными для Saccharomyces cerevisiae кодонами и создана система их секреторной экспрессии. Показано, что штаммы S. cerevisiae, синтезирующие и секретирующие в среду эти пептиды, подавляют рост молочнокислых бактерий. Использование спиртовых дрожжей, продуцирующих антибактериальные пептиды, увеличивало выход этанола в условиях бактериального инфицирования. Спиртовые дрожжи S. cerevisiae, секретирующие в среду антибактериальные пептиды педиоцин и плантарицин, могут быть рекомендованы для замены существующих промышленных линий дрожжей при производстве этанола.
Ключевые слова: Saccharomyces cerevisiae, антибактериальные пептиды, педиоцин, плантарицин, производство этанола.
DOI: 10.7868/S055510991505013X
Бактериальное заражение существенно осложняет промышленное производство этанола, которое является нестерильным процессом. Наиболее распространено заражение сусла молочнокислыми бактериями, для которых характерна высокая скорость роста, толерантность к спирту и способность к росту при низких значениях рН [1]. Бактериальное заражение уменьшает количество сахаров, сбраживаемых в этанол, а уксусная и молочная кислоты, выделяемые бактериями, подавляют рост дрожжей.
Для борьбы с бактериальным заражением обычно используют антибиотики: пенициллин, виргиниамицин и др. [2, 3]. Однако, использование антибиотиков повышает затраты на производство этанола и приводит к появлению анти-биотикорезистентных форм бактерий. В связи с этим, нами разработан новый способ борьбы с бактериальным заражением при ферментации, основанный на использовании сконструированных штаммов спиртовых дрожжей, синтезирующих и секретирующих в ферментационную среду антибактериальные пептиды — бактериоцины.
Бактериоцины представляют собой короткие белки, синтезирующиеся на рибосомах граммпо-ложительными и граммотрицательными бактериями [4]. Эти антибактериальные пептиды прояв-
ляют активность против близкородственных видов бактерий или имеют более широкий спектр действия. Гены, кодирующие бактериоцины у грамположительных бактерий, локализованы на плазмидах [5]. В настоящее время бактериоцины, синтезируемые граммположительными микроорганизмами из семейства молочнокислых бактерий, нашли широкое применение в пищевой промышленности, где они используются в качестве консервантов для замены нитратов, нитритов и двуокиси серы [6—9].
Помимо бактериоцинов, синтезируемых бактериями, известны антибактериальные пептиды, продуцируемые эукариотами. Гены таких пептидов были экспрессированы в клетках Pichia pastoris [10—13], Saccharomyces cerevisiae и Aspergillus oryzae [14]. Предполагается, что в дальнейшем эти антибактериальные пептиды найдут применение в качестве антисептических средств, в диагностике и профилактике ряда заболеваний, а также в качестве добавок в корм животных. Перспективно также использование бактериоцинов, продуцируемых молочнокислыми бактериями, при производстве этанола.
Бактериоцины разделяют на два класса. Бакте-риоцины, относящиеся к первому классу, характеризуются узким спектром антибактериального
действия, бактериоцины второго класса ингиби-руют рост различных видов граммположительных бактерий. Среди них особый интерес представляют бактериоцины, относящиеся к классу 11а антибактериальных пептидов, которые характеризуются наличием в их структуре двух дисульфидных связей и более высокой удельной активностью, чем пептиды с одной дисульфидной связью в М-конце-вом домене [15—17]. Антибактериальное действие этих пептидов обеспечивается первоначальным связыванием М-концевого домена с мембраной клеток—мишеней посредством электростатического взаимодействия с последующим проникновением С-концевого домена в гидрофобную область мембраны [18—20]. В результате связывания бактериоцинов повышается проницаемость мембраны, что приводит к гибели клеток.
Гены двух бактериоцинов (педиоцина и план-тарицина), относящихся к классу 11а антибактериальных пептидов, были ранее клонированы в клетках генетических линий S. cerevisiae под контролем дрожжевого промотора ADH1p [6, 21]. В обоих случаях источниками генов служили плазмиды, выделенные из соответствующих молочнокислых бактерий. Показано, что рекомби-нантные штаммы дрожжей подавляют рост молочнокислых бактерий. Эти данные свидетельствуют о принципиальной возможности синтеза биологически активных антибактериальных пептидов дрожжами S. cerevisiae. Однако, ингибиру-ющая активность бактериоцинов, секретируемых дрожжами, была низкой и обнаруживалась только после концентрирования культуральной жидкости, полученной при выращивании рекомби-нантных дрожжей. Использование рекомбинант-ных дрожжей с антибактериальной активностью при производстве этанола для подавления заражения возможно только после существенного увеличения продукции бактериоцинов. Это может быть достигнуто путем увеличения числа копий генов бактериоцинов в рекомбинантных штаммах, применения сильных промоторов для их транскрипции, а также использования оптимальных для дрожжей кодонов.
Цель работы — конструирование рекомбинант-ных штаммов спиртовых дрожжей, продуцирующих антибактериальные пептиды, для предотвращения бактериального заражения при производстве этанола.
МЕТОДИКА
Штаммы и условия культивирования. Штамм E. coli TG1 (supE, hsdA5, thiA(lac-proAB), F'[traD36proAB + lacIqlacZ AM15] ("Stratagene",
Великобритания) использовали для клонирования генов педиоцина и плантарицина, а также для препаративной наработки ДНК.
Культуру E. coli выращивали на ротационной качалке при 37°С в среде LB [22] или на чашках Петри с агаризованной средой LB . В случае необходимости в среду добавляли ампициллин (100мкг/мл). Трансформацию E. coli выполняли по стандартной методике c использованием RbCI [23].
Микроорганизмы, используемые в качестве индикаторных штаммов (Lactobacillus sakei, Pedi-acoccuspentasaceus, Pediacoccus acidilactici и Carno-bacterium piscicola) были любезно предоставлены В.А. Лившиц ("ГосНИИ генетика", Москва). Молочнокислые бактерии выращивали в жидкой среде MRS (De Man-Rogosa-Sharpe, "HiMedia Laboratories", Индия) на ротационной качалке при 28°C.
Штамм спиртовых дрожжей S. cerevisiae № 778, имеющий мутацию в гене ura3, был получен в лаборатории оптимизации экспрессии генов Института биохимии им. А.Н. Баха РАН ранее. Дрожжи культивировали или в жидкой среде (дрожжевой экстракт — 1%, соевый пептон — 2%) c 2% глюкозы (YPD) на ротационной качалке при 250 об./мин, или на чашках Петри с агаризованной средой YPD при 28°C. В опытах по сбраживанию глюкозы ее концентрацию в среде повышали до 25%.
Трансформацию клеток штамма S. cerevisiae №778 плазмидами pTDH-Plantaricin и pTDH-Pe-diocin проводили по методике, предложенной Хил с соавт. [24]. Экспрессионные кассеты, содержащие гены антибактериальных пептидов, перед трансформацией были линеаризованы эн-донуклеазой рестрикции MluI. Отбор трансформантов проводили по отсутствию ауксотрофности по урацилу на агаризованной синтетической минимальной среде MD, следующего состава (г/л): YNB (Difco TMYeast Nitrogen Base производства "Becton, Dickinson", США) без аминокислот — 17, (NH4)2SO4 - 50, глюкоза - 20.
Конструирование плазмид. Синтез генов педио-цина и плантарицина с предпочтительными для дрожжей S.cerevisiae кодонами [21] осуществляли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием олигонуклеотидов П1-П4 в случае генаpedA и П5-П8 в случае генаplaA. Олиго-нуклеотиды синтезировали в ЗАО "Синтол" (Россия). Сайты рестрикции Nco1 и Xho1 выделены жирным шрифтом.
MuI (240)
Рис. 1. Структура экспрессионного вектора pTDH/antibacterial_peptide, содержащая гены антибактериальных пептидов — педиоцина и плантарицина.
П1 dir 5'-ataccatggaaaaaagaaaatattatggtaatggtgttacttgtgg-3' П2 dir 5'-ttaattggggtcaagcattttcttgttctgtttctcatttggctaa-3' П3 rev 5'-cttgaccccaattaacagaacaagaatgtttaccacaagtaacacc-3' П4 rev 5'-tatctcgagttaacatttaccatgaccaaaattagccaaatgagaa-3' П5 dir 5' -аtaccatggaaaaaagaaaatattatggtaatggtgttacttgtggtaaaca-3' П6 dir 5'-aaagctctacttgtattattaataatggtgctatggcttgggctactggtg-3' П7 rev 5'-acaagtagtagctttaccccaatcaacagaacaagaatgtttaccacaagta-3' П8 rev 5'-tatctcgagttaacatttatgattaccttgatgaccaccagtagcccaag-3'
Синтезированные ПЦР-продукты очищали с помощью электрофореза в агарозном геле и выделяли, используя DNA Extraction Kit ("Thermo Fisher Scientific Inc.", США). ПЦР-фрагменты фланкированы сайтами рестрикции NcoI, XhoI. После обработки эндонуклеазами рестрикции NcoI и XhoI геныplaA иpedA были клонированы в челночном (E. coli-S. cerevisiae) векторе pTDH (из коллекции лаборатории, рис. 1) под контролем конститутивного TDH3р промотора. При синтезе генов, кодирующих антибактериальные пептиды, и их клонировании использовали препараты эн-донуклеаз рестрикции, Т4 ДНК-лигазу и ДНК полимеразу Taq фирмы "Thermo Fisher Scientific
Inc." (США). Для исключения ошибок ПЦР-по-следовательности генов были секвенированы. Полученные плазмиды названы pTDH-Plantari-cin и pTDH-Pediocin.
Определение антибактериальной активности. Активность полученных трансформантов определяли по методу Флеминга [25]. Колонии трасфор-мантов S. cerevisiae c интегрированными генами педиоцина или плантарицина суспендировали в 100 мкл физиологического раствора и по 20 мкл наносили на YPD агар в чашки Петри. После высыхания капель чашки выдерживали 40—48 ч при 28°C. Ночную культуру молочнокислых бактерий вносили в количестве 1—2% в мягкий 0.7%-ный
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.