ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2011, том 47, № 2, с. 187-193
УДК 663.5
СПОСОБНОСТЬ К АНАЭРОБНОМУ РОСТУ И АКТИВНОСТЬ СПИРТОВОГО БРОЖЕНИЯ У МИКРОСКОПИЧЕСКИХ ГРИБОВ
© 2011 г. А. В. Кураков*, К. С. Хидиров**, В. С. Садыкова***, Д. Г. Звягинцев**
*Международный биотехнологический центр МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва 119991
e-mail: kurakov57@mail.ru **Факультет почвоведения МГУ ***Биологический факультет МГУ Поступила в редакцию 12.04.2010 г.
На основе предложенного метода проведено выделение грибов в анаэробных условиях и установлены различия в их численности и видовом составе в разных местообитаниях. На представительной выборке (344 штаммов более 60 видов) определена способность микромицетов разных таксонов к анаэробному росту и спиртовому брожению. Среди грибов, растущих в анаэробных условиях, выявлены виды с высокой, умеренной и низкой активностью брожения. Способность к анаэробному росту и брожению зависела от таксономической принадлежности. В ряде случаев проявление этих свойств зависело от местообитания, из которого штамм был выделен. Максимальный уровень накопления этанола в культуральной жидкости (1.2—4.7%) обнаружен у Absidia spinosa, Aspergillus sp. группы flavus, Aspergillus terreus, Acremonium sp., Mucor circinelloides, Mucor sp., Fusarium oxysporum, F. solani, F. sambucinum, Rhizo-pus arrhizus var. arrhizus, Trichoderma atroviride, Trichoderma sp.
При производстве этилового спирта используются отобранные расы дрожжей (Saccharomyces cerevisi-ae, Candida scottii, C. tropicales) и бактерий [1—3]. Значительно меньше внимания уделяли изучению способности мицелиальных микроскопических грибов к брожению, так как их традиционно рассматривали как аэробные организмы. Вместе с тем в природе эти грибы часто встречаются в местообитаниях с ограниченной обеспеченностью кислородом. Значительное количество грибного мицелия сохраняет жизнеспособность в длительно инкубируемых в восстановительных условиях почвах, в затопляемых болотных почвах и верховых болотах [4—6]. В последние годы появились сведения о способности микромицетов к росту в анаэробных условиях и спиртовому брожению [6, 7], причем не только представителей родов Mucor, Rhyzopus, Fusarium, что было известно ранее [8—11].
Микроскопические грибы представляют особый интерес для получения этанола из растительных полимерных субстратов, так как многие из них являются продуцентами активных гидролаз. Штаммы таких грибов могли бы использоваться для переработки растительного материала, для гидролиза полимерных субстратов в аэробных условиях и сбраживания сахаров при лимитированной обеспеченности среды кислородом.
Цель работы — оценка активности спиртового брожения у мицелиальных микроскопических грибов разных таксонов, выделенных из различных местообитаний.
МЕТОДИКА
Объекты исследования. При поиске изолятов грибов, обладающих способностью к спиртовому брожению, исходили из предположения, что они должны характеризоваться хорошим ростом в анаэробных условиях на средах с простыми сахарами. Для исследования было отобрано 344 штамма микроскопических грибов, разных таксономических групп. Чистые культуры микромицетов были изолированы из образцов почв, отобранных в различных регионах и экотопах — дерново-подзолистой почвы, выщелоченного чернозема и с рисовых полей, растительных остатков, донных илов и затопляемых грунтов вдоль водоемов, плодовых тел макромице-тов, семян хвойных и злаковых растений, торфа верхового болота, корней болотных растений и растений гидроморфных лугов, погребенных почв, культурных слоев из раскопа античного города Фанагории (Краснодарский край, Россия), верми-компоста, пищеварительного тракта дождевых червей и личинок усачей.
Большинство отобранных штаммов (320 из 344) были выделены стандартным посевом на чашки Петри на среды Чапека и сусло-агар и выращиванием в атмосфере воздуха при 25°С. 24 штамма были отобраны из культур, изолированных из природных образцов непосредственно при анаэробной инкубации посевов.
Анаэробное выделение грибов. Выделение грибов в анаэробных условиях проводили методом посева мелкозема свежих образцов современных почв, культурных слоев и погребенных почв, фрагментов
корней, растительных материалов, содержимого пищеварительного тракта безпозвоночных на глюко-зо-пептонную среду следующего состава (г/л): KH2PO4 - 1.0, KCl - 0.5, MgSO4 - 0.5, FeSO4 - 0.01, (NH4)2SO4 - 2.0, агар - 15.0 г/л, пептон - 5.0, глюкоза - 5.0, дрожжевой экстракт - 0.5, а также 1 мл/л раствора микроэлементов (мг/л): ЭДТА - 500, FeCl2 • • 7H2O - 200, ZnCl2 • 7H2O - 10, MgCl2 • 4H2O - 3, H3BO4 - 30, CoCl2 • 6H2O - 2, CuCl2 • 2H2O - 1, Na2MoO4 - 3, NiCl2 • 6H2O - 2. Для подавления роста бактерий в стерильную, расплавленную среду добавляли антибиотики стрептомицин и хлорамфе-никол в концентрации 200 мг/л среды. Чашки Петри с посевным материалом помещали в специальные пластиковые боксы ("BioMerieux Co", Франция) и инкубировали в течение 7-10 сут в анаэробных условиях при 25°С. Анаэробиоз создавали с помощью газовых анаэробных пакетов "GENbox anaer", ("BioMerieux Co", Франция). Поглощение кислорода и повышение уровня диоксида углерода в боксах происходило в течение 2.5 ч. Анаэробиоз в них контролировали индикаторами на основе резазурина ("Oxoid Limited", Англия). Такой подход к созданию безкислородной атмосферы был ранее использован для анаэробного культивирования бактерий [12, 13]. В данной работе он применен для проверки способности к анаэробному росту чистых культур грибов и для их выделения в анаэробных условиях из природных объектов. В этом случае необходимо использовать оптимальные для роста грибов среды с дрожжевым экстрактом или витаминами) и микроэлементами, более низкую температуру (25°С), добавлять в повышенной дозе антибактериальные антибиотики и инкубирование проводить 1-2 нед.
Из каждого местообитания было проанализировано не менее 10 образцов.
Идентификация изолятов грибов. Идентификацию микроскопических грибов осуществляли по культурально-морфологическим признакам по соответствующим для конкретной систематической группы определителям [14-18].
30 изолятов, которые принадлежали к разным систематическим группам согласно определению по культурально-морфологическим признакам, были идентифицированы с помощью ПЦР-ам-плификации с последующим сиквенированием амплификонов и их анализом (GenBank Data system: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/, http:// rdp.cme.msu.edu/html/, http://www.arb-home.de). Чистоту штаммов на наличие бактерий-спутников или бактериальной контаминации контролировали микроскопией и высевом на среды с цик-логексимидом.
Оценка роста грибов в анаэробных условиях. Способность к росту в анаэробных условиях у штаммов, изолированных при инкубации посевов в атмосфере воздуха, проверяли на глюкозо-минеральной среде
или агаризованной среде Чапека с дрожжевым экстрактом и микроэлементами (рН 6.5). В среды добавляли 1 мл/л раствора микроэлементов (г/л): Na2B4O7 • 10H2O - 0.8; NaMoO4 • 2H2O - 0.8; FeSO4 • • 2H2O - 0.4; CuSO4 • 5H2O - 0.4; MnSO4 • 2H2O - 0.8; ZnSO4 • 7H2O - 0.8. Чашки Петри помещали в герметичные пластиковые боксы с генераторами анаэробной атмосферы и индикаторами анаэробиозиса. Посев инкубировали в течение 7-14 сут при 25°С, при наличии роста грибов оценивали размеры их колоний и рассчитывали радиальную скорость роста [19].
Оценка активности спиртового брожения штаммов в анаэробных условиях. Активность брожения штаммов грибов оценивали по накоплению этанола в культуральной жидкости в анаэробных условиях. Мицелий предварительно выращивали на жидкой среде Чапека в течение 4-6 сут, отмывали в стерильной дистиллированной воде и переносили во флаконы объемом 100 мл с 50 мл глюкозо-минеральной среды при содержании глюкозы - 1, 4 и 5%. У ряда наиболее активных культур продукция этанола была определена при более высоких концетрациях глюкозы (10 и 20%). Флаконы закрывали резиновыми пробками, воздух замещали на N2 при продувании азотом в течение 1 мин и инкубировали в течение 1 нед. при 25°С. Содержание спирта определяли в отфильтрованной культуральной жидкости на 4 и 7 сут на газо-жидкостном хроматографе (Московский опытный завод, Россия, модель Chrom 3700 с пламенно-ионизационным детектором, колонка SOVPOL (1.5 м), газ-носитель - аргон, температура колонки 160°С, испарителя 240°С, детектора 250°С).
Для расчета удельной активности образования этанола определяли биомассу грибов во флаконах после завершения опыта. Мицелий промывали дистиллированной водой и высушивали при 60-70°С до постоянного веса [19]. Рассчитывали также эффективность сбраживания глюкозы до этанола.
Для определения эндоглюканазной активности грибов использовали среду с микрокристаллической целлюлозой ("Sigma", type 100, США) следующего состава (г/л водопроводной воды): KH2PO4 - 1.0, MgSO4 - 0.5, KCl - 1.0, NaNO3 - 2.0, FeSO4 - 0.01, CaCl2 (CaCO3) - 0.04, дрожжевой экстракт - 0.02, микрокристаллическая целлюлоза - 8.0. Колбы на 250 мл со стерильной жидкой средой (100 мл) иноку-лировали мицелием и спорами и культивировали на качалке (120 об/мин) при 28°C в течение 7 сут. Куль-туральную жидкость отбирали в пластиковые пробирки на 2 мл и удаляли из нее мицелий и остатки целлюлозы центрифугированием (2 мин, 14000 g). Эндоглюканазную и ксиланазную активности в пробах определяли по накоплению восстанавливающихся сахаров, сахара - методом Шомоди-Нель-сона с глюкозой в качестве стандарта. В качестве субстрата использовали 1%-ные растворы карбок-симетилцеллюлозы (КМЦ) и березового ксилана
Таблица 1. Микроскопические грибы, изолированные из различных местообитаний в анаэробных условиях
Род/вид Почва Погребенная почва и культурные слои Верховой торф и зеленые мхи Корни и растительные субстраты Место обитания ассоциированные с беспозвоночными
Acremonium sp. +
Aspergillus niger + + +
Aspergillus sp. гр. flavus + +
Clonostachys rosea f. rosea + + +
Cunningamella elegans +
Fusarium oxysporum + + +
F. solani + +
Fusarium spp. + + + +
Mucor circinelloides +
Mucor hiemalis + +
Mucor spp. + + +
Rhizopus arrhizus var. arrh
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.