научная статья по теме СПОСОБНОСТЬ КЛЕТОК АДАПТИРОВАТЬСЯ К УСЛОВИЯМ НИЗКОГО СОДЕРЖАНИЯ КИСЛОРОДА СВЯЗАНА С ГЛУТАТИОНИЛИРОВАНИЕМ NA,K-ATРАЗЫ Биология

Текст научной статьи на тему «СПОСОБНОСТЬ КЛЕТОК АДАПТИРОВАТЬСЯ К УСЛОВИЯМ НИЗКОГО СОДЕРЖАНИЯ КИСЛОРОДА СВЯЗАНА С ГЛУТАТИОНИЛИРОВАНИЕМ NA,K-ATРАЗЫ»

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2015, том 49, № 1, с. 175-183

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ

УДК 577.2,57.05

СПОСОБНОСТЬ КЛЕТОК АДАПТИРОВАТЬСЯ К УСЛОВИЯМ НИЗКОГО СОДЕРЖАНИЯ КИСЛОРОДА СВЯЗАНА С ГЛУТАТИОНИЛИРОВАНИЕМ Ка,К-АТРазы

© 2015 г. И. Ю. Петрушанко1, О. В. Симоненко1, К. М. Бурнышева1, Е. А. Климанова2, Е. А. Дергоусова2, В. А. Митькевич1, О. Д. Лопина2, А. А. Макаров1*

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, Москва, 119991 2Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва, 119992

Поступила в редакцию 14.07.2014 г. Принята к печати 28.07.2014 г.

Снижение содержания кислорода в тканях, наблюдаемое при целом ряде патологических процессов, неизбежно приводит к их повреждению. Одна из главных причин повреждения и гибели клеток в условиях гипоксии — нарушение работы систем поддержания ионного баланса. Ингибирование активности №,К-АТРазы, основного ион-транспортирующего белка плазматической мембраны животных клеток, происходящее при снижении концентрации кислорода, считается одним из самых ранних и критичных для жизнеспособности клеток событий. В настоящее время проводится активный поиск модуляторов активности №,К-АГРазы. Традиционно с этой целью используют сердечные гликозиды, однако вызываемые ими тяжелые побочные эффекты вынуждают искать альтернативные ингибиторы №,К-АТРазы. Ранее нами было обнаружено, что глутатионилирование каталитической субъединицы №,К-АТРазы приводит к полному ингибированию фермента. В представленной работе показано, что вещества, увеличивающие уровень глутатионилирования №,К-АТРазы: этилглутатион (et-GSH), окисленный глутатион (GSSG) и N-ацетилцистеин (NAC), повышают выживаемость клеток в условиях недостатка кислорода, предотвращают падение уровня АТР и нормализуют редокс-статус клеток. Установлен диапазон концентраций, в котором проявляется максимальный защитный эффект этих веществ и отсутствуют выраженные цитотоксические свойства: 0.2—0.5 мМ — у et-GSH, 0.2—1 мМ — у GSSG, 10—15 мМ — у NAC. Полученные результаты показывают перспективность разработки методов защиты тканей от повреждения в условиях кислородного голодания путем изменения степени глутатионилирования №,К-АТРазы.

Ключевые слова: №,К-АТРаза, гипоксия, ишемия, истощение АТР, защита от окисления, глутатионилирование, внутриклеточный редокс-статус.

THE ABILITY OF CELLS TO ADJUST TO THE LOW OXIGEN CONTENT ASSOCIATED WITH Na^-ATPase GLUTATIONILATION by I. Yu. Petrushanko1, O. V. Simonenko1, K. M. Burnysheva1, E. A. Klimanova2, E. A. Dergousova2, V. A. Mitkevich1, O. D. Lopina2, A. A. Makarov1* (1Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow, 119991 Russia; *e-mail: aamakarov@eimb.ru; 2Department of Biology, Moscow State University, Moscow, 119992 Russia). Decreasing the amount of oxygen in the tissues under hypoxic and ischemic conditions, observed at a number of pathologic processes, inevitably leads to their damage. One of the main causes of cell damage and death is a violation of the systems maintaining ionic balance. Na^-ATPase is a basic ion-transporting protein of animal cell plasma membrane and inhibition of the Na^-ATPase activity at lower concentrations of oxygen is one of the earliest and most critical events for cell viability. Currently there is an active search for modulators of Na^-ATPase activity. For this purpose traditionally used cardiac glycosides but the existence of serious adverse effects forced to look for alternative inhibitors of Na,&ATPase. Previously we have found that the glutathionylation of Na^-ATPase catalytic subunit leads to a complete inhibition of the enzyme. In this paper it is shown that the agents which increase the level of Na^-ATPase glutathionylation: ethyl glutathione (et-GSH), oxidized glutathione (GSSG) and N-acetyl cysteine (NAC), increase cell survival under oxygen deficiency conditions, prevent decline of ATP in the cells and normalize their redox status. Concentration range in which these substances have a maximum protective effect, and does not exhibit cytotoxic properties was defined: for et-GSH 0.2-0.5 mM, for GSSG 0.2-1 mM, for NAC 10 to 15 mM. The results show prospects for development of methods for tissues protection from damage caused by oxygen starvation by varying the degree of Na^-ATPase glutathionylation.

Keywords: Na^-ATPase, hypoxia, ischemia, ATP depletion, anti-oxidation, glutathionylation, intracellular redox-state.

DOI: 10.7868/S0026898415010140

* Эл. почта: aamakarov@eimb.ru

Гипоксия, т.е. снижение содержания кислорода в тканях ниже физиологического уровня, которая всегда сопровождает ишемию, наблюдается при целом ряде патологических процессов, включая сердечно- и нейрососудистые заболевания, развитие которых может приводить к инфаркту миокарда и инсульту. Гипоксия, неизбежно вызывающая повреждение тканей, наблюдается также при сахарном диабете, различных легочных патологиях и хирургических вмешательствах [1, 2]. Острая и хроническая ишемия сердца и головного мозга является одной из основных причин смертности и инвалидизации населения России. Восстановление кровообращения в гипоксиче-ских тканях может приводить к их дополнительному повреждению из-за развития окислительного стресса [1].

Одна из главных причин повреждения и гибели клеток при гипоксии — нарушение работы ион-транспортирующих систем и ионного баланса, необходимого для нормальной жизнедеятельности клеток [3—7]. №,К-ЛТРаза, основной ион-транспортирующий белок плазматической мембраны животных клеток, создает градиент Na+ и К+, необходимый для жизнеспособности клеток. Функциональный мономер №,К-АТРазы состоит из каталитической а-субъединицы и регуля-торной Р-субъединицы. Субъединица а содержит участки связывания АТР, Na+ и К+, она ответственна за гидролиз АТР и транспорт ионов. Регу-ляторная Р-субъединица необходима для встраивания а-субъединицы в мембрану и окклюзии ионов калия [8]. На поддержание работы Na,K-ЛТРазы тратится существенная часть внутриклеточных запасов АТР — от 20% в мышечной ткани до 80% в головном мозге [3]. Ингибирование активности №,К-АТРазы при гипоксии считается одним из самых ранних событий при гипоксии, критичном для жизни клеток [7, 9, 10]. Краткосрочное ингибирование фермента носит адаптивный характер, в частности, позволяет экономить АТР, образование которого снижается при гипоксии, а также приводит к увеличению концентрации внутриклеточного натрия, ингибиро-ванию №+-Са2+-обменника, повышению концентрации внутриклеточного кальция. В кар-диомиоцитах это вызывает усиление сердечных сокращений, что позволяет улучшить кровоснабжение тканей [11]. Однако длительное нарушение ионного баланса, обусловленное ингибированием №,К-АТРазы, приводит к гибели клеток.

Для стимуляции сердечной деятельности в настоящее время используют сердечные гликозиды (уабаин, дигоксин и др.), действие которых основано на ингибировании №,К-АТРазы [12]. Эти препараты применяют при застойной сердечной недостаточности, кардиогенном шоке, наруше-

нии ритма сердца. Подавление активности Na,K-АТРазы сердечными гликозидами позволяет снизить повреждение ткани миокарда при ишемии— реперфузии [13]. Однако сердечные гликозиды не только непосредственно ингибируют №,К-АТРазу, но и вызывают активацию целого ряда сигнальных каскадов в клетках, а их длительное применение приводит к развитию различных патологий, таких как гиперкалемия, гипертрофия сердца и т.д. [14, 15]. Более того, достаточно сложно подобрать эффективные дозы сердечных гликозидов, при которых отсутствуют токсические проявления. Ин-гибируя №,К-АТРазу, сердечные гликозиды не снижают риска ее необратимого повреждения активными формами кислорода (АФК) при гипоксии, а реактивация фермента в таких условиях затруднена.

В настоящее время ведется активный поиск альтернативных регуляторов активности №,К-АТРа-зы. Мы предположили, что физиологическим ре-докс-чувствительным регулятором №,К-АТРазы может быть внутриклеточный трипептид глутати-он. Присоединение глутатиона не только защищает тиоловые группы белков от необратимого окисления и потери функции, но и регулирует активность целого ряда белков [16]. Нами показано, что уровень глутатионилирования а-субъединицы №,К-АТРазы в миокарде крыс возрастает при гипоксии и сопровождается ингибированием фермента вследствие блокирования связывания с АТР [17]. Глутатионилирование №,К-АТРазы при гипоксии можно рассматривать как физиологический механизм защиты клеток, предотвращающий необратимое окисление белка и снижающий потребление АТР клеткой. В представленной работе впервые изучено глутатионилирование а-субъединицы №,К-АТРазы в культурах клеток в условиях недостатка кислорода. Показано, что вещества, увеличивающие уровень глутатионилирования №,К-АТРазы: этилглутатион (et-GSH), окисленный глу-татион (GSSG) и N-ацетилцистеин (NAC), повышают выживаемость клеток при гипоксии, предотвращают падение уровня АТР и нормализуют внутриклеточный редокс-статус. Определен диапазон концентраций, в котором эти вещества оказывают максимальный защитный эффект и не проявляют выраженных цитотоксических свойств. Показана перспективность разработки методов защиты тканей от повреждения в условиях недостатка кислорода, основанных на изменении степени глутатионилирования №,К-АТРазы.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Клеточные культуры. Использовали эмбриональные клетки мыши линии SC1. Клетки выращивали в питательной среде ДМЕМ с высоким

содержанием глюкозы (4.5 г/л) ("Invitrogen"), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки ("Invitrogen"), 2 мМ глутамина ("ПанЭко"), 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина ("Invitrogen"), при 37°С в атмосфере 5% СО2. Клетки рассаживали в стерильные чашки Петри (35 х 10 мм) для адгезивных клеточных культур ("Corning-Costar") по 400000 клеток на чашку.

Вещества, изменяющие редокс-статус клетки.

Хлординитробензол (CDNB, "Sigma"), диэтил-малеат (DEM, "Sigma") — вещества, образующие конъюгаты с глутатионом и приводящие к снижению его уровня внутри клеток; нитрозоглутатион (GSNO, "Sigma") — произв

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком