ОНТОГЕНЕЗ, 2014, том 45, № 3, с. 170-179
УДК 575.22;575.224
СПОСОБЫ ОЦЕНКИ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКОГО ГОМЕОСТАЗА В ПРИРОДНЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ ЖИВОТНЫХ НА РАЗНЫХ ЭТАПАХ ОНТОГЕНЕЗА
© 2014 г. К. Г. Орджоникидзе, Т. Б. Демидова*, Е. Ю. Крысанов*
Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН 119991, Москва, ул. Губкина, 3 *Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН 119071, Москва, Ленинский пр. 33 E-mail: krysanov@sevin.ru Поступила в редакцию 11.12.13 г. Окончательный варинт получен 14.01.14 г.
В статье рассмотрены современные методы оценки генетического гомеостаза животных. Подробно рассмотрены такие методы как ДНК-комет тест, микроядерный тест, хромосомные аберрации и сестринские хроматидные обмены. Рассмотрены вопросы чувствительности данных методов и особенности их применения для оценки генетического гомеостаза в естественных популяций животных.
Ключевые слова: генетический гомеостаз, ДНК-комет тест, микроядра, аберрации хромосом, сестринские хроматидные обмены, окружающая среда, животные, онтогенез.
DOI: 10.7868/S0475145014030033
Организм на протяжении всего своего развития подвергается воздействию весьма разнообразных факторов как внешних, так и внутренних. Одной из главных особенностей живого организма является способность к поддержанию гомеостаза, как на уровне целого организма, так и отдельных его составляющих. В нормальных условиях организм реагирует на воздействие среды посредством сложной физиологической системы буферных гомеостатических механизмов. Эти механизмы поддерживают оптимальное протекание процессов развития. Под воздействием неблагоприятных условий эти механизмы могут быть нарушения. Такие нарушения гомеостаза могут происходить до появления изменений, обычно используемых в качестве параметров жизнеспособности живых существ.
Изменения гомеостаза отражают базовые изменения функционирования живых существ и находят выражение в процессах, протекающих на разных уровнях, от молекулярного до организменно-го, и соответственно, могут быть оценены по различным параметрам с использованием различных методов. Способность поддерживать относительное постоянство и целостность генетических систем можно назвать генетическим гомеостазом.
Существуют разнообразные методы оценки генетического гомеостаза организма от молекулярных до цитогенетических. В настоящем обзо-
ре мы попытаемся рассмотреть ограниченный набор цитогенетических методов оценки генетического гомеостаза ориентируясь в основном на их приложение к естественным популяциям животных на разных стадиях онтогенеза. Прямого или опосредованного химико-токсикологического анализа биологического образца недостаточно для понимания возможной опасности для живых организмов тех или иных воздействий. Необходима комплексная оценка реакции организма на разных уровнях его организации на те или иные токсические воздействия.
К основным цитогенетическим методам такого рода можно отнести анализ частот повреждений ДНК, визуализируемых в виде ДНК-комет, микроядер, хромосомных аберраций и сестринских хроматидных обменов.
В настоящее время наиболее часто употребимыми являются ДНК-комет-тест и микроядерный тест, тогда как анализ хромосомных аберраций и сестринских хроматидных обменов встречается сравнительно редко.
Также необходимо отметить, что в данном обзоре основное внимание будет уделено применению этих методов in vivo.
ДНК-КОМЕТ
Гель-электрофорез единичных клеток (Comet Assay) является одним из наиболее перспективных методов в мониторинге генотоксического действия широкого спектра как антропогенных, так и природных факторов на животных и растениях in vivo. Данный высокочувствительный метод позволяет оценить первичные повреждения ДНК, которые, впоследствии, как известно, могут приводить к возникновению хромосомных аберраций и нарушению процессов клеточной пролиферации и дифференцировки, к апоптозу или развитию патологий различных тканей и органов. Следствием нарушений целостности генетического материала может оказаться снижение репродуктивного успеха животных, являющегося залогом успешного существования популяции. Таким образом, экотоксикологические параметры среды обитания и реакции на них биологических объектов представляют особенную важность при изучении экологии видов в контексте их взаимодействия с факторами окружающей среды.
Предложенный в 1978 г. (Rydberg, Johanson, 1978) и усовершенствованный впоследствии (Olive, Banáth, 2006) метод основывался на принципе миграции ДНК клеток, иммобилизированных в агарозный гель и помещенных в электрическое поле. Преимуществом метода явилась его способность регистрировать повреждения ДНК на уровне единичной клетки. Позднее он был усовершенствован для регистрации целого ряда явлений (апоптоз, репарация, последствия некоторых физиологических состояний, оксидативный стресс) на различных тканях животных (Koppen, Verschae-ve, 1996). В последнее десятилетие появилось большое количество работ, посвященных изучению ге-нотоксического действия физических факторов (ионизирующая радиация, электромагнитное излучение), а также новых материалов, таких как на-ночастицы и нанотрубки (Oberdörster et al., 2005).
Основными этапами проведения теста ДНК-комет являются: получение гель-слайдов, получение микропрепаратов клеток, лизис, электрофорез, фиксация, окрашивание и микроскопический анализ слайдов.
Для получения гель-слайдов предметные стекла покрывают 1% агарозным гелем, в который вносят исследуемые клетки. Гель с клетками наносят на подготовленные гель-слайды. После затвердевания клетки подвергают лизису, во время которого происходит диссоциация клеточных структур и выпетливания хроматина в поры агаро-зы. При электрофорезе под влиянием электрического поля ДНК мигрирует к аноду в виде отдельных фрагментов или петель и формирует электро-форетический след, напоминающий хвост кометы, параметры которого зависят от количества разрывов в ДНК. После электрофореза препараты фиксируют и окрашивают флуоресцирующими кра-
сителями, применяемыми для визуализации ДНК — этидиум бромид, пропидиум бромид, акридиновый оранжевый, CYBR Green I, YOYO-I, DAPI. Микропрепараты анализируют на флуоресцентном микроскопе с использованием высокочувствительной камеры и программного обеспечения, что позволяет проводить цифровую обработку геометрии комет (Оценка генотоксических свойств ..., 2010). При подобном способе анализа препаратов в качестве показателей поврежденности ДНК используют следующие основные показатели: длина хвоста, процентное содержание ДНК в хвосте и "момент хвоста" (произведение первых двух перечисленных параметров). При визуальном анализе ДНК-кометы ранжируются на несколько условных типов, а степень поврежденности вычисляется по формуле для индекса комет (отношение суммы числа комет каждого типа к общей сумме подсчитанных комет) (Collins, Dusinská, 2002; Collins, 2004; Olive, Banáth, 2006).
Существует два основных варианта метода ДНК-комет — нейтральный, при котором регистрируются двунитевые разрывы и щелочной, когда помимо двунитевых регистрируются также однонитевые. Последний вариант расширяет возможности оценки генотоксических факторов, однако требует дополнительных манипуляций: щелочной денатурации при рН > 13, в результате которой щел очно-лабильные сайты реализуются в однонитевые разрывы, щелочного электрофореза и нейтрализации слайдов.
К преимуществам данного метода можно отнести относительную простоту манипуляций, невысокую стоимость проведения исследования, высокую чувствительность, возможность исследовать любой биологический материал, в том числе малого объема или полученный в полевых условиях, что важно в экологических и геноток-сикологических исследованиях.
Существует ряд работ, посвященных использованию метода ДНК-комет в качестве биоиндикаторного теста для экологической оценки влияния возможных генотоксикантов на окружающую среду, в частности, судя по реакции со стороны населяющих данную область организмов.
Наиболее популярными объектами в экологических исследованиях акваторий являются пресноводные и морские моллюски. Слободсковой с соавт. в 2010 г. была проведена оценка геноток-сичности среды обитания на Дальнем Востоке на степень повреждения молекулы ДНК жаберных клеток эстуарного двустворчатого моллюска Cor-bicula japonica, Prime (Слободскова и др., 2010). Объектом другого исследования послужили пресноводные моллюски, обитающие на территории радиационно-экологического заповедника в зоне загрязнения Чернобыльской АЭС. В ходе данного исследования авторам удалось, помимо оценки загрязненности территорий, выявить различия в
уровнях пролиферативной активности гемоцитов моллюсков (Конева, 2013). Помимо моллюсков объектами для оценки состояния водной среды также являются различные виды проживающих на потенциально загрязненных территориях рыб семейства карповых, пециллиевых и т.д. (Russo et al., 2004; Стяжкина и др., 2011). Кроме изучения прямого воздействия гентоксических агентов рассматриваемый метод применяется для рассмотрения, к примеру, процессов репарации у глубоководных организмов, подверженных воздействию высокого давления (Pruski, Dixon, 2003).
В целом анализ литературы позволяет сделать заключение, что метод ДНК-комет прекрасно зарекомендовал себя в экотоксикологическом мониторинге водной среды.
Сухопутные организмы значительно реже выступают в качестве тест-объектов в экотоксико-логических исследованиях. Из беспозвоночных можно отметить почвенных червей (Verschaeve, Gilles, 1995) и кузнечика (Augustyniak et al., 2013). Эти животные являются удобными индикаторами степени загрязнения почв солями тяжелых металлов или источниками ионизирующих излучений.
Одной из положительных сторон метода ДНК-комет является возможность проведения нескольких этапов теста в полевых условиях, когда хранение и транспортировка биологического материала могут оказаться трудоемкими или исказить итоговую картину исследования. Так, в исследованиях зависимости повышения степени повреждения ДНК на обитающих вблизи угольных карьеров представителях семейства тукотуковых, авторы проводили лизис в местах сбора материала, упаковывали образцы и
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.