НЕЙРОХИМИЯ, 2012, том 29, № 3, с. 223-228
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ^^^^^^^^^^^^ РАБОТЫ
УДК: 612.822
СРАВНЕНИЕ ЭФФЕКТОВ ОДНОКРАТНОЙ И ТРЕХКРАТНОЙ УМЕРЕННОЙ ГИПОБАРИЧЕСКОЙ ГИПОКСИИ НА ЭКСПРЕССИЮ Си, /п-СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ В ГИППОКАМПЕ КРЫС
© 2012 г. С. А. Строев1,2, Е. И. Тюлькова1, М. О. Самойлов1, *, М. Т. Пелто-Хьюкко2
Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, Санкт-Петербург, Россия 2Медицинская школа университета г. Тампере, Финляндия
Ранее было показано, что прекондиционирование тремя сеансами умеренной гипобарической гипоксии усиливает и ускоряет повышение экспрессии Си, /п-СОД в ответ на последующую тяжелую гипоксию в нейронах гиппокампа крыс. В то же время само по себе прекондиционирование (без последующей тяжелой гипоксии) не только не повышает, но в некоторых областях гиппокампа достоверно снижает экспрессию Си, /п-СОД. В настоящей работе ранее исследованная иммуноцитохи-мическим методом экспрессия Си, /п-СОД через 3 и 24 ч после последнего сеанса трехкратной умеренной гипобарической гипоксии сравнивается с экспрессией фермента в те же сроки после первого сеанса, т.е. после однократной умеренной гипоксии. Показано, что однократная гипоксия оказывает на экспрессию Си, /п-СОД эффект, в целом сходный с эффектом трехкратной гипоксии. При сопоставлении четырех временных точек в ходе прекондиционирования (3 и 24 ч после первого сеанса и третьего сеансов) отмечаются волнообразные колебания уровня экспрессии Си, /п-СОД, которые могут играть важную роль в модификации ответа на последующую тяжелую гипоксию, т.е. в механизме формирования гипоксической толерантности нейронов гиппокампа.
Ключевые слова: Cu, Zn-сутроксиддисмутаза, гиппокамп, умеренная гипобарическая гипоксия, прекондиционирование, иммуноцитохимия.
ВВЕДЕНИЕ
Окислительный стресс, связанный с гиперпродукцией свободных радикалов, является ключевым фактором повреждения и гибели клеток в ходе тяжелой гипоксии/ишемии и последующей реок-сигенации. Эндогенные антиоксиданты, включая Си, /п-СОД, дезактивируют свободные радикалы и, тем самым, играют важную роль в молекулярно-клеточных механизмах адаптации к гипоксии и в формировании гипоксической толерантности.
Ранее было показано, что однократная тяжелая гипобарическая гипоксия (3 ч, 180 мм рт. ст.) существенно повышает общее число иммунопозитив-ных к Си, /п-СОД нейронов и число интенсивно экспрессирующих Си, /п-СОД нейронов в гиппо-кампе крыс к 24 ч (но не к 3 ч) с момента окончания воздействия [1, 2]. Данная реакция может, по-видимому, по своей природе рассматриваться как попытка нейропротекции, однако слишком запоздалая. Механизмы отсроченной клеточной гибели, согласно современным представлениям, запуска-
* Адресат для корреспонденции: 199034 Санкт-Петербург, наб. Макарова, 6; e-mail: samoilov@pavlov.infran.ru. Принятые сокращения: Cu, Zn-СОД— Cu, Zn-супероксид-дисмутаза, CA — cornu Ammonis (Аммонов рог), DG — dentate gyrus (зубчатая извилина), АФК — активные формы кислорода.
ются уже через 2—4 ч после окончания тяжелой гипоксии [3], поэтому компенсация гиперпродукции активных форм кислорода спустя почти сутки после ее индукции уже не может изменить судьбу клетки. В итоге в данной экспериментальной модели действительно наблюдается массовая гибель нейронов в новой коре и гиппокампе к 7 суткам после тяжелой гипоксии [4, 5].
Предварительное прекондиционирование тремя сеансами умеренной гипобарической гипоксии (2 ч, 360 мм рт. ст., 1 раз в сутки) приводит к тому, что существенное повышение экспрессии Си, /п-СОД происходит уже к 3 ч после окончания тяжелой гипоксии [1, 2], т.е. к моменту, критическому для запуска апоптотической программы [3]. При этом количество гибнущих в неокортексе и гиппо-кампе к 7 сут после тяжелой гипоксии нейронов существенно снижается [4, 5]. На основании этих данных был сделан вывод о том, что перенос индукции Си, /п-СОД на более ранний, критический для запуска апоптоза, срок играет, по-видимому, свою роль в реализации молекулярных механизмов индуцируемой прекондиционированием гипоксической толерантности нейронов [1, 2].
В то же время само по себе трехкратное прекон-диционирование к моменту перед началом тяжелой гипоксии (24 ч после последнего третьего сеанса умеренной гипоксии) ни в одной из исследо-
ванных областей гиппокампа не повышает, а в CA1 и CA2 даже заметно снижает общее число иммуно-реактивных к Cu, Zn-СОД нейронов и число интенсивно экспрессирующих ее нейронов [6]. Эти данные свидетельствуют о том, что трехкратное прекондиционирование повышает экспрессию Cu, Zn-СОД вслед за последующей тяжелой гипоксией не за счет повышения "фонового" уровня экспрессии данного белка, а за счет модификации ответа на саму тяжелую гипоксию [6].
Оставалось, однако, невыясненным, каким образом на экспрессию Cu, Zn-СОД влияет однократная умеренная гипоксия или, иными словами, что происходит с экспрессией Cu, Zn-СОД в процессе прекондиционирования.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследования проводили на трех группах (по 6 животных в каждой) взрослых крыс-самцов линии Вистар весом 200—250 г. Первая и вторая группы подвергались соответственно одно- и трехкратному (1 раз в сутки) воздействию умеренной гипобарической гипоксии по 2 ч в барокамере проточного типа при давлении 360 мм рт. ст. (что соответствует подъему на высоту 5000 м). Третью группу составляли контрольные животные, которых также помещали в барокамеру трехкратно, по 2 ч в сут, но при нормальном давлении. Уровень экспрессии Cu, Zn-СОД определяли иммуно-цитохимическим методом в структурах гиппокам-па через 3 и 24 ч после гипоксических воздействий.
Для проведения иммуноцитохимического анализа анестезированных животных перфузировали транскардиально сначала 100 мл физиологического раствора, затем в течение 4—5 мин — 4%-ным раствором параформальдегида в 0.1 M фосфатном буфере (PBS; pH 7.3). После окончания перфузии животных декапитировали, мозг извлекали и в течение 60 мин фиксировали тем же фиксатором. До начала анализа образцы мозга хранили в 15%-ном растворе сахарозы в фосфатном буфере PBS при температуре +4°С.
Ткань замораживали в Tissue-Tek®R O.C.T™ Compound (Sakura Finetek) и немедленно с помощью криоката при температуре —20°C делали фронтальные срезы мозга толщиной 11 микрон на уровне гиппокампа и базо-латеральной миндалины (примерно —2.80 мм от линии bregma [7]).
Срезы помещали на предметные стекла, покрытые поли-L-лизином (Sigma) и в течение 15 мин преинкубировали в 1%-ном растворе бычьего сывороточного альбумина (BSA, Boehringer Mannheim GmbH). Затем в течение ночи инкубировали с первичными поликлональными аффин-но-очищенными кроличьими антителами к Cu, Zn-СОД быка (разведение 1 : 200 в фосфатном буфере PBS, содержащем 1% BSA и 0.3% Triton
X-100, [8]) при +4°С. Затем, после трехкратной промывки в фосфатном буфере (по 15 мин каждая), срезы инкубировали с биотинилированными козьими вторичными антителами (Vector Labs, разведение 1 : 300) в течение 30 мин при комнатной температуре. После повторной трехкратной промывки в фосфатном буфере, срезы в течение 30 мин инкубировали с авидин-биотиновым комплексом (Vector Labs) при комнатной температуре. Для визуализации иммунной реакции и выявления локализации Cu, Zn-СОД использовали диа-минобензидин. Срезы обезвоживали проводкой в спиртовых растворах возрастающей концентрации, а затем в ксилоле и заключали в бальзам Entellan.
Количественный анализ иммунореактивности нейронов проводили с использованием системы, состоящей из микроскопа (Nikon Microphot-FXA), камеры (PCO Computer Optics GmbH) и компьютера с программами Image-Pro Plus (Media Cybernetics) и Morphix [9].
Уровень экспрессии Cu, Zn-СОД определяли в нейронах Аммонова рога (области СА1, СА2 и СА3) и зубчатой извилины (DG) гиппокампа. Анализ изображений проводили на участке длиной 500 мкм. Уровень иммунореактивности нейронов исследуемых образований оценивали в шести срезах от каждого мозга. Интенсивность окрашивания на цифровых изображениях выражали в условных единицах оптической плотности от 0 (абсолютно белого) до 100 (абсолютно черного). Иммунореактивные клетки подразделяли на два условных класса: слабо окрашенные (окраска на 1—10 условных единиц интенсивнее фона) и интенсивно окрашенные (более чем на 10 условных единиц интенсивнее фона). Уровень иммунореак-тивности оценивался по двум критериям: общему числу иммунореактивных клеток, выраженному в процентах от контроля (N+) и числу интенсивно окрашенных клеток, также выраженному в процентах от контроля (Ni). Статистическую обработку данных проводили посредством однофакторно-го дисперсионного анализа (ANOVA).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Иммуноцитохимический анализ показал, что одно- и трехкратная умеренная гипобарическая гипоксия оказывают в целом сходный и однонаправленный эффект на экспрессию Cu, Zn-СОД в гиппокампе крыс.
В области CA1, как было показано ранее, через 3 ч после трехкратной умеренной гипобарической гипоксии наблюдается статистически достоверное по сравнению с контролем повышение общего числа иммунопозитивных клеток (N+ = 135 ± 9%) и некоторое, статистически недостоверное, повышение числа интенсивно экспрессирующих Cu,
«
ч
о &
я
о м н о
160 140 120 100 80 60 40 20 0
„ СА2 N+
СА1 N+
120
я л 100
о
тро 80
н
о к 60
т
о 40
20
0
Контроль 1-кратная 3-кратная
24 часа 24 часа
1-кратная 3-кратная
3 часа 3 часа
120
я100 л
тро 80 н о к т о
60 40 20 0
- СА3 ^ 140
- Г4! * Л нн ля120 I100 онт 80
- Й 60 ^ 40
| | 1 1 20 -1 0
Контроль 1-кратная 3-кратная
24 часа 24 часа
1-кратная 3-кратная
3 часа 3 часа
БО ^
Контроль 1-кратная 3-кратная
24 часа 24 часа
1-кратная 3-кратная
3 часа 3 часа
Контроль 1-кратная 3-кратная
24 часа 24 часа
1-кратная 3-кратная
3 часа 3 часа
Рис. 1. Изменения общего числа Си, Zn-СОД-иммунореактивных клеток (Ы+) в различных образованиях гиппокампа крыс через 3 и 24 ч после трехкратной умеренной гипобарической гипоксии, выраженное в процентах к контролю. Статистическая достоверность (Р < 0.05): * — по сравнению с контролем, # — на 24-часовом сроке по сравнению с 3-часовым.
Z
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.