БИОФИЗИКА, 2015, том 60, вып. 3, с. 471-480
МОЛЕКУЛЯР НАЯ БИОФИЗИКА =
УДК 577.3
СРАВНЕНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ
ДИГИДРОФОЛАТРЕДУКТАЗЫ E. coli И ЧЕЛОВЕКА: И ССЛЕДОВАНИЕ РАВНОВЕСНОГО РАЗВО РАЧИВАНИЯ
© 2015 г. Ч. Таплиял, Н. Джейн*, П. Чаудхури (Чаттопадхуай)
Институт биотехнологийуниверситета Амити, UP-201303, Уттар-Прадеш, Ноида, сектор-125, Индия;
*Школа биологических наук Индийского института тех нологий Дели, Индия E-mail: ргайтаскаийНип@уакоо.сот Поступила в p едакцию
Различающиеся по происхождению белки могут проявлять разное физико-химическое поведение, иметь отличия в гомологии последовательностей, фолдинге, функциях. Поэтому изучение структурно-функциональной взаимосвязи белков из разных источников значимо в том смысле, что может привести к открытию сравнительных особенностей их взаимосвязей в ряду «последовательность-структура-функции». Дигидрофолатредуктаза - не только фермент, участвующий в регуляции клеточного цикла, но и значимый фермент при разработке противораковых препаратов. Поэтому детальное понимание структурно-функциональных взаимоотношений обширного числа вариантов дигидрофолатредуктазы будет иметь важное значение при подборе ингибитора или антагониста к данному ферменту, участвующему в процессах клеточного процессах развития. В представленной работе сообщается о сравнительной структурно-функциональной связи между дигидрофолатредуктазой E. соИ и человека. Различия в характере разворачивания этих двух белков исследовались для понимания различий таких свойств этих белков, как их относительная стабильность и конформационные изменения при идентичных условиях денатурации. Механизм равновесного разворачивания дигидрофолатредуктазы при использовании гидрохлорида гуанидина в качестве денатурирующего агента и в присутствии различных типов осмолитов наблюдали путем регистрации ферментативной активности, а также собственной флуоресценции триптофана и внешнего флуорофора 8-анилино-1-нафта-линсульфоновой кислоты в качестве зонда. Обнаружено, что такие осмолиты, как 1 М сахароза и 30% глицерин, обеспечивают повышенную стабильность обеих дигидрофолатредуктаз, причем степень стабилизации зависит от собственной стабильности белка, тогда как 100 мМ пролина не оказывают значимого стабилизирующего эффекта. Показано также, что дигидрофолатредуктаза человека относительно менее стабильна, чем ее аналог из E. соИ.
Ключевые слова: дигидрофолатредуктаза E. соИ и человека, развертывание дигидрофолатредуктаз, мониторинг разворачивания дигидрофолатредуктаз, флуоресцентная спектроскопия, осмолиты и стабилизация дигидрофолатредуктаз.
Белки - одни из самых важных макромолекул в клетке, контр олирующие пр актически все биологические процессы. Продуцирование и детальная характеризация различных белков облегчаются благодаря их гетерологичной экспрессии и очистке [1]. Белок может быть функционально активен только тогда, когда приобретает уникальную 3Б-конформацию за счет замысловатого пути сворачивания, на который влияют первичная аминокислотная последовательность и локальная клеточная среда [2]. С во-рачивание белка является жизненно важным для живого организма, поскольку добавляет
Сокращения: ДГФР - дигидрофолатредуктаза, АНС -8-анилино-1-нафталинсульфоновая кислота, GdnHCl -гидрохлорид гуанидина.
плоть к скелету гена. Незначительные ошибки в процессе сворачивания могут привести к неправильно свернутым структурам, что иногда приводит к летальному исходу [3-5]. Однако в клеточной среде, имеющей высокую вязкость, многие белки не могут свернуться должным образом самостоятельно и нуждаются в помощи распространенных белков особого рода - молекулярных шаперонов. Молекулярные шапе-роны помогают другим белкам достичь функционально активной 3Б-структуры и таким образом предупреждают формирование неправильно свернутых или агрегировавших структур.
Дигидр офолатр едуктаза (ДГФР, Е С 1.5.1.3) является важным ферментом, который превращает дигидрофолат в тетрагидрофолат с ис-
пользованием НАДФН как донора электр онов. «Челночная» метильная группа, переносчиком которой является тетр агидрофолат, необходима для первичного синтеза пуринов, тимидиловой кислоты и некотор ых аминокислот. ДГФР очень важна как мишень для пр отивор аковых препаратов благодаря ингибированию мето-трексатом. К р оме значимости в качестве фармакологической мишени, ДГФР пр ивлекла внимание специалистов в химии белка как модель для изучения отношений структура/функция у фер ментов из-за малого размер а молекулы и доступности очищенного фермента. Подбор антагонистов или ингибиторов для любого фермента требует знания структур но-функциональ-ных связей белка и оптимальных конформаци-онных состояний для проявления максимальной и минимальной активности. Более того, подбор ингибиторов или медикаментозных препаратов, воздействующих на фермент, становится проще, если имеется инфор мация о различных хорошо охарактеризованных промежуточных конфор-мациях молекулы. Фолдинг in vivo любого ре-комбинантного белка является важным параметром для понимания его способности к самостоятельному сворачиванию внутри клетки, что всегда определяет последующую процедуру очистки [6].
Есть работы по сравнению конформаций активных участков ДГФР человека и E. coli. Для ДГФР кишечной палочки предлагается гипотетическая модель для связывания субстрата, в которой птеридиновое кольцо переворачивается «с ног на голову», в то время как все атомы белка и растворителя остаются неподвижными [7]. Также были опубликованы пред-вар ительные исследования связывания ингибиторов метотрексата и триметоприма с апофер-ментом человека [8]. Конформации химически очень похожих лигандов метотрексата и фо-лиевой кислоты (первый - субстр ат, а вторая -мощный ингибитор) различаются, по существу, в том, что их птеридиновые кольца ориентированы противоположно по отношению к их р-аминобензоил-Ь-глутамат-фрагментам. Связывание метотрексата аналогично тому, что ранее наблюдалось у двух бактериальных ферментов, но довольно сильно отличается от такового для фермента из клеточной линии лим-фомы мышей [9]. Геометрия полипептидной цепи вокруг участка связывания фолата в ферменте человека не согласуется с выводами, сделанными ранее в отношении видовой селективности ингибитора триметоприма [10]. Таким образом, активные центры ДГФР E. coli и человека различаются по отношению к их кон-
формациям вокруг областей связывания субстрата.
C учетом важной роли ДГФР, существенными являются структурно-функциональные исследования этого фермента. Более того, поскольку ДГФР пр исутствует почти во всех типах прокариотических и эукар иотических клеток, также важно сравнение физико-химических характеристик ДГФР из различных источников.
В данной статье мы ср авниваем физико-химические параметры ДГФР E. coli и человека путем исследования траекторий разворачивания этих белков с помощью биохимических и биофизических подходов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалы. Штаммы BL21 E. coli и Rosetta E. coli были использованы для экспрессии и очистки ДГФР E. coli и человека соответственно. Плазмиды ДГФР E. coli, клонированные в рЕТ16Ь-вектор, содержащий (His)б-ДГФP, с благодарностью приняты от д-ра Тагучи, UEDA-группа, Япония. Плазмида ДГФР человека в векторе рЕТ43.1а, содержащем (His)6, получена от д-ра Цзы Фан, Тайвань. Изопро -пиловый P-D-1-тиогалактопиранозид, 8-анили-но-1-нафталинсульфоновая кислота (АНС), ди-гидрофолатредуктаза, никотинамид-аденин-ди-нуклеотидфосфат (НАДФН) и гидро хлорид гуа-нидина (GdnHCl) приобретены у Sigma Chemi-са1 Сотрапу (США). Имидазол высокого класса чистоты и хлорид натрия приобретены у компании Merck (Индия). Остальные используемые реагенты были аналитической чистоты.
Сверхэкспрессия и очистка рекомбинантных ДГФР. Компетентные клетки BL21 (DE3) / Rosetta (DE3) E. coli были получены с использованием CaCl2 с помощью метода, описанного в работе [11]. Компетентные клетки трансформировали с помощью плазмиды ДГФР E. coli в рЕТ16Ь-векторе и с помощью плазмиды ДГФР человека в рЕТ43.1а-векторе соответственно, и выр ащивали на агар овой ср еде Лур иа-Бер тани, содержащей ампициллин в конечной концентрации 100 мкг/мл. E. coli, содержащие реком-бинантную плазмиду, His^ET16b ДГФР E. coli и His^ET43.1a ДГФР человека, выращивали в течение ночи при 37°С в 10 мл бульона Луриа, содер жащего 100 мкг/мл ампициллина. Эту первичную культуру использовали для инокуляции 1 л того же бульона. Экспрессию и очистку ДГФР E. coli и человека проводили методом металл-аффинной хроматографии (Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography, IMAC) с использованием Ni2+ в качестве хелатирующего агента согласно протоколам, приведенным в
работах [12] и [13] соответственно. Очистка обеих дигидр офолатр едуктаз была подтвер жде-на электр офоретическим анализом клеточного экстракта сверхэкспрессированных белков на 12% SDS-PAGE [14].
Определение концентрации белка c использованием реагента Брэдфорда. Концентрацию ДГФР определяли путем окрашивания по методу Б рэдфорда с использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта. Разбавленный в 50 раз белковый экстракт инкубировали с реагентом Брэдфорда при комнатной температуре в течение 20 мин, концентрацию белка оценивали по оптической плотности раствора на длине волны 595 нм.
Анализ ферментативной активности ДГФР. Активность ДГФР определяли методом кинетической спектро скопии при использовании следующей реакционной схемы [15]:
Анализ основан на способности дигидро-фолатредуктазы катализировать обратимое НАДФН-зависимое восстановление дигидр офо-лата до тетрагидрофолиевой кислоты. Ход реакции регистрировали по уменьшению оптической плотности пр и длине волны 340 нм. Контрольная проба не содержала ДГФР и служила для оценки вклада от НАДФН. Оказалось, что величина оптической плотности «слепой» про -бы незначительна по сравнению с результатом анализа в присутствии ДГФР. Следовательно, снижение концентрации НАДФН в присутствии ДГФР относится только к ферментативной реакции.
Снижение концентрации НАДФН регистрировали путем измерения поглощения при длине волны 340 нм и темпер атуре 25°С. С та
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.