ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2007, том 43, № 6, с. 670-676
УДК 579.862.1:577.113
СРАВНЕНИЕ ГЕНОТИПИЧЕСКИХ И БИОХИМИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК ШТАММОВ Streptococcus thermophilus, ВЫДЕЛЕННЫХ
ИЗ КИСЛОМОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ
© 2007 г. С. Г. Ботина, М. Ä. Тренина, Ю. Д. Цыганков, В. В. Суходолец
Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных
микроорганизмов, Москва, 117545 e-mail: svetabotina@yahoo .com Поступила в редакцию 20.06.2006 г.
Проведен анализ 72 штаммов молочнокислых термофильных стрептококков, выделенных из кисломолочных продуктов, изготовленных в различных регионах России и стран Европы с применением классических микробиологических и молекулярно-биологических методов. Изучены физиолого-биохими-ческие свойства и генетическое разнообразие штаммов Streptococcus thermophilus и проведен сравнительный анализ данных о нуклеотидных последовательностях гена 16S рРНК. Показано, что все изученные штаммы обнаруживают гомологию проксимальной части гена 16S рРНК по отношению друг к другу и к типовому штамму этого вида АТСС19258 на уровне 100%, а по способности ферментации сахаров некоторые штаммы характеризуются свойствами, нетипичными для представителей вида Streptococcus thermophilus. На основании полученных данных делается заключение о предпочтительности использования результатов секвенирования гена 16S рРНК при идентификации природных изолятов близкородственных видов молочнокислых бактерий и рекомендации использования этого метода для точной видовой идентификации промышленных штаммов бактерий, использующихся в приготовлении пищевых продуктов.
Молочнокислые бактерии, выделенные из различных источников, в том числе и из высококачественных пищевых продуктов, микрофлора которых сформирована естественным путем, чаще всего относятся к следующим родам: Lactobacillus, Lactococcus, Micrococcus, Pediococcus, Staphylococcus, Streptococcus и Enterococcus. Термофильные кокки, выделяемые из различных природных источников и кисломолочных продуктов, в большинстве случаев представляют собой культуры бактерий, принадлежащих к родам Streptococcus и Enterococcus, причем многими исследователями справедливо отмечается трудность при идентификации бактерий этих родов c использованием только фенотипических методов классификации [1-3]. Авторами описаны несоответствия классических фенотипических признаков, таких, как способность роста на среде с желчью, ферментация сахаров и эскулина, антибиотикоустойчивость, а также диапазон температур роста, присущих бактериям этих родов. Бактерии видов Streptococcus thermophilus и Enterococcus durans, E. faecium, E. faecalis трудноотличимы при идентификации их именно фенотипическими методами, поскольку они обладают сходными фенотипическими характеристиками. Нередки также штаммы, обладающие свойствами, общими с энтерококками и стрептококками, что сильно затрудняет их идентификацию [4]. Термофильные молочнокислые
бактерии Streptococcus thermophilus - немногочисленные представители "полезных" бактерий этого рода, с точки зрения их практического применения в качестве заквасочных культур при изготовлении кисломолочных продуктов. Большинство бактерий рода Streptococcus - это патогены. Они являются возбудителями инфекционных болезней животных (мыт лошадей, мастит крупного рогатого скота) и человека (скарлатина, ангина). Так, бактерии Streptococcus agalactiae могут вызывать сепсис и менингит у новорожденных, S. mutans -кариес, S. gordonii - заболевания ротовой полости, S. pyogenes является патогенным для человека, инфицируя кожные покровы. В связи с тем, что в России ведутся работы по поиску отечественных конкурентоспособных стартовых бактериальных культур для пищевой промышленности, актуальным является исследования, направленные на изучение физиолого-биохимических, ге-нотипических и производственно-ценных свойств штаммов молочнокислых бактерий.
Цель работы - сравнение биохимических и ге-нотипических характеристик коллекции штаммов бактерий вида Streptococcus thermophilus с применением микробиологических методов, основанных на изучении ферментативных свойств штаммов, а также с использованием молекулярно-биологических подходов, направленных на изучение разнообразия в строении гена 16S рРНК для
выявления корреляции между данными, полученными различными методами идентификации бактерий.
МЕТОДИКА
Штаммы бактерий. Объектами исследования служили 72 штамма из нашей коллекции молочнокислых бактерий, выделенные из кисломолочных продуктов (йогурт, сметана, сыры, простокваша, творог, кислое молоко), изготовленных в разных регионах России, странах СНГ, Италии, Хорватии, Словении, Франции, Италии. Информация об использованных в работе штаммах приведена в таблице. Типовой штамм Streptococcus thermophilus АТСС 19258 был приобретен в Американской коллекции типовых культур.
Выделение чистых культур и культивирование. Стерильным шпателем отбирали 50 мкл образца кисломолочного продукта, который переносили в пробирку с 1 мл физиологического раствора и тщательно ресуспендировали. Затем из этого раствора делали серию разведений. После чего производили высев материала разного разведения на агаризованную питательную среду М21 следующего состава (%): пептон - 1.0, дрожжевой экстракт - 1, мясной бульон - 30, сахар (лактоза) - 5, аскорбиновая кислота - 0.1, KH2PO4 - 0.2, Na2HPO4 - 0.85, MgSO4 - 0.012, агар - 1.5, рН 7.0. Чашки инкубировали в термостате при 42°С в течении 48 ч. Отдельные колонии использовали для получения чистой культуры и дальнейшего микроскопического исследования.
Микроскопирование. Использовали микроскоп фирмы "Rathenow" (Германия) и стандартные методики окрашивания грамположительных кокков.
Ферментация Сахаров. Способность бактерий ферментировать сахара тестировали с использованием тест-системы API 50 CHL фирмы "Био Мерье" (Франция), а также на среде М21 с анализируемым углеводом в концентрации 10 г/л и красителем бромкрезоловым пурпурным (БКП) в концентрации 32 мг/л. Об утилизации сахара судили по приобретению колониями и питательной средой желтой окраски.
Ферментация эскулина. Способность бактерий расщеплять эскулин определяли с использованием среды следующего состава (%): казеиновый пептон - 0.5, мясной экстракт - 0.3, цитрат железа - 0.05, эскулин - 0.1, агар - 1.5, рН 6.6. Бактерии выращивали в течение ночи в термостате при 42°С. При ферментации эскулина наблюдали потемнение среды вокруг выросших колоний и потерю ею способности к флюоресценции.
Тест на каталазу. Культуру клеток смешивали с 4%-ным раствором пероксида водорода. В случае положительной реакции на каталазу выделя-
ется водород, о чем свидетельствует появление пузырьков газа.
Устойчивость к соли. Способность бактерий расти в присутствии NaCl исследовали на среде М21 с добавлением соли в концентрации от 2 до 6%.
Получение препаратов ДНК. Выделение проводили с использованием набора Wizard® Genomic DNA Purification Kit фирмы "Promega" (США), согласно протоколу изготовителя.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР). ПЦР
проводили с использованием реактивов фирмы "АмплиСенс" (Россия), праймеров, синтезированных с помощью синтезатора ДНК ASM-800 фирмы "Biosset" (Россия). При проведении ПЦР использовались праймеры 8f: 5'-aga gtt tga tcc tgg ctc ag- 3'[5] и 1492r: 5'-ggt tac ctt gtt acg act t- 3' [6], позволяющие проводить амплификацию гена 16S рРНК. Tемпературно-временнóй профиль ПЦР был следующим: 94°5' [94° 30" (денатурация ДНК); 55° 30" (отжиг праймеров); 72°1' (элонгация)] 35 циклов; 72°4' (окончательная полимеризация); 4° - хранение. Амплификацию проводили в термоциклере "Master Cycler Gradient" фирмы "Eppendorf" (Германия). Продукты ПЦР анализировали при помощи электрофореза в камере SE-2 фирмы "Helikon" (Россия) в 1%-ном агарозном ТБЕ-геле фирмы "АмплиСенс" (Россия).
Выделение и очистка амплифицированной
ДНК. Использовали набор GenElute Minus EtBr Spin Columns фирмы "Sigma" (США), согласно протоколу изготовителя.
Определение нуклеотидной последовательности генов 16S рРНК. Определение проводили по методу Сэнгера, как описано нами ранее [4], се-квенирование проводили с использованием прайме-ра 8f, позволяющего определять нуклеотидную последовательность проксимального участка гена 16S рРНК, при помощи автоматического анализатора ДНК CEQ8000 Beckman-Coulter фирмы "Beckman" (Германия).
Анализ нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК. Использовали программу Blast в Internet (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). Результаты секвенирования анализировали с использованием компьютерной программы Vector NTI: ContigExpress. Множественное выравнивание последовательностей проводили в программе ClustalX, филогенетический анализ, построение дендро-грамм и расчет генетических расстояний - в программе Mega2.1 в Internet (http://www.megasoft-ware.net).
Для сравнения нуклеотидных последовательностей генов рибосомальных РНК у термофильных стрептококков нами были использованы последовательности (номера указаны в скобках) этого гена, характерные для разных видов рода Streptococcus, депонированные в GenBank NCBI:
Штаммы бактерий, ферментируемый ими углевод, регион происхождения
Название штамма Ферментируемый углевод Регион или страна выделения Название штамма Ферментируемый углевод Регион или страна выделения
BC103 Лактоза, глюкоза Московская об- BC234 Лактоза, глюкоза, сахароза Тверская область
ласть
BC104 » Словения BC235 » »
BC105 » » BC236 Лактоза, глюкоза, сахароза, »
раффиноза
BC106 » » BC238 Лактоза, глюкоза, сахароза Украина
BC112 » » BC239 » »
BC113 » » BC240 » »
BC115 » » BC241 Лактоза, глюкоза, сахароза, »
рибоза
BC117 » Московская об- BC245 Лактоза, глюкоза, сахароза Словения
ласть
BC118 » Словения BC246 » »
BC119 » » BC247 » »
BC120 » Московская об- BC248 » »
ласть
BC123 » Украина BC257 » Иркутская область
BC125 » » BC259 » Бурятия
BC127 » » BC309 » Хорватия
BC128 » » BC310 Лактоза, глюкоза »
BC130 » » BC311 Лактоза, глюкоза, сахароза »
BC131 » » BC312 Лактоза, сахароза »
BC201 Лактоза, глюкоза, Хорватия BC313 Лактоза, глюкоза, сахароза »
сахароза
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.