СЕНСОРНЫЕ СИСТЕМЫ, 2008, том 22, № 4, с. 309-316
ЗРЕНИЕ
УДК 612.019
СРАВНЕНИЕ СИСТЕМ АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИТЫ В ГЛАЗАХ ДВУХ ПОПУЛЯЦИЙ КРЕВЕТОК MYSIS RELICTA (CRUSTACEA: MYSIDACEA), ОТЛИЧАЮЩИХСЯ ПО ИХ УСТОЙЧИВОСТИ К ФОТОПОВРЕЖДЕНИЮ
© 2008 г. Т. Б. Фельдман, А. Е. Донцов, М. А. Яковлева,
И. Б. Федорович, М. Линдстрем1, К. Доннер1, М. А. Островский
Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля, РАН 119991 ГСП-1, Москва, ул. Косыгина, д. 4, E-mail: lina.invers@gmail.com 1 Тверминская Зоологическая станция Университета Хельсинки, Финляндия Поступила в редакцию 07.06.2008 г.
Проведено сравнительное исследование активности систем антиоксидантной защиты двух популяций креветок Mysis relicta - озерной популяции (ОП) и морской популяции (МП). Креветки ОП обитают на большой глубине и значительно чувствительнее к повреждающему действию света, чем креветки МП, обитающие в Балтийском море на меньших глубинах. Показано, что глаза креветок Mysis relicta содержат все возможные компоненты антиоксидатной защиты, включая экранирующие антиокислительные пигменты оммохромы и каротиноиды. Антиоксидантная активность гомо-гената глаз МП, а также их водорастворимой фракции, выше, чем у ОП. Активности антиоксидант-ных ферментов супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы и содержание - а-токоферола в обеих популяциях креветок сопоставимы. Качественный состав каротиноидов в глазах МП и ОП одинаков, хотя имеется отличие в содержании астаксантина, которого в глазах МП втрое больше. Наблюдаемое отличие в антиоксидантной активности МП и ОП связано, по-видимому, с адаптационными изменениями к различающимся условиям световой среды обитания. Основной вклад в различную устойчивость глаз двух популяций креветок к фотоповреждению вносит, скорее всего, разница в количественном содержании гранул оммохромов, которых у МП существенно больше. Предполагается, что причинами большей уязвимости глаз ОП к фотоповреждению может быть большое содержание фототоксических продуктов и/или более высокое содержание легко окисляющихся полиненасыщенных жирнокислотных остатков в составе мембранных структур.
Ключевые слова: Crustacea, Mysis relicta, глаз, антиоксиданты, оммохромы, антиоксидантные ферменты, витамин Е, каротиноиды, световая адаптация.
ВВЕДЕНИЕ
В Скандинавии в конце ледникового периода (около 9000 лет назад) сформировались озера, в которых оказались многие морские виды животных. Среди них были креветки рода мизид (Mysi-dacea), а именно, креветка опоссум Mysis relicta. Существуют две финские популяции этих креветок - морская и озерная, принадлежащих одному и тому же виду, и генетически очень похожих (Vainola, 1986).
Креветки морской популяции (МП) обитают на относительно небольших глубинах в заливе Пойо, который является частью Балтийского моря (Lindstrom, Nilsson, 1988), креветки озерной популяции (ОП) живут на большой глубине (>40 м) глубоководного озера Пааярви. Несмотря на генетическое сходство, их зрение заметно отличается по световой и спектральной чувствительности. Озерная популяция в отличие от МП теряет зрение уже в условиях умеренного дневного осве-
щения (Ыпёв^бт, №1ввои, 1988; Ьтёв^бт й а1., 1988). Эти популяции креветок представляют отличную модель для изучения защитных систем, предохраняющих зрительный пигмент родопсин и мембраны микровилл ретинулярных клеток от действия прооксидантных факторов.
Ранее мы показали, что креветки МП содержат в структурах глаза почти вдвое больше экранирующих пигментов оммохромов омминового типа, по сравнению с креветками ОП (Бойвоу й а1., 1999). Известно, что оммохромы способны ин-гибировать фотоиндуцированные повреждения мембран, действуя как в качестве светофильтра, так и как эффективные антиоксиданты (Ов^о-увку й а1., 1987). Мы предположили, что более высокая устойчивость МП к световому повреждению может быть связана с большей активностью у них защитных систем против окислительного стресса, включая более высокую концентрацию оммохромов.
В настоящей работе продолжено сравнительное исследование активности антиоксидантных систем и их компонентов в глазах этих двух популяций Mysis relicta.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Креветки МП были выловлены с глубины примерно 25-30 м в заливе Пойо Балтийского моря при помощи механической лебедки и прикрепленного к концу троса пластикового стакана. Светопропускание воды залива имеет максимум, находящийся между 565 и 585 нм (Lindstrom, Nils-son, 1988; Lindstrom, 2000). Креветки ОП выловлены с глубины 60-80 м глубоководного темного озера Паарви (максимальная глубина озера 86 м) при помощи вертикальной сети, закрепленной на лебедке и имеющей специальную ловушку. Максимум светопропускания озерной воды находится между 600-700 нм и эта вода имеет очень высокий коэффициент поглощения света. Глаза ОП креветок очень чувствительны к световому повреждению, поэтому креветки были выловлены ночью. В процессе лова и обработки животных на судне использовали либо очень слабые источники света, либо инфракрасный свет и инфракрасный конвертер. Животных помещали в темные контейнеры с озерной водой, обогащенной кислородом, при температуре, соответствующей условиям их нормального обитания, и перевозили на Тверминскую Зоологическую станцию (Университет Хельсинки), где проводили эксперименты. Здесь животных держали в специальных аквариумах при 4°С.
Животных декапитировали, глазные стебельки отрезали и собранные глаза помещали в стеклянный гомогенизатор. Все операции были выполнены под бинокуляром. Для приготовления сухих образцов взвешивали 20 глаз, добавляли к ним 1 мл 96%-ного этанола и сушили на воздухе. После этого повторно добавляли 1 мл 96%-ного этанола и высушивали глаза вплоть до достижения постоянного веса. В качестве контроля 2 мл 96%-ного этанола выпаривали на воздухе и определяли вес остатка.
Глаза креветок Mysis relicta (30-40 штук) помещали в стеклянный гомогенизатор, содержащий 1.0-1.5 мл охлажденного натрий-фосфатного буфера (рН 7.4). Глаза тщательно растирали до получения однородного гомогената, после чего го-могенат центрифугировали при 14 g в течение 5 мин при 4°C на центрифуге "Sigma 3K12". Осадок отбрасывали, а оставшийся гомогенат использовали как субстрат в реакции пероксидации, индуцированной ионами двухвалентного железа.
Глаза креветок Mysis relicta (40-50 штук) тщательно гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе, содержащем 1.0-1.5 мл холодного на-
трий-фосфатного буфера (рН 7.4). Полученный гомогенат центрифугировали при 2125 g в течение 15 мин при 4°С. Осадок отбрасывали, а прозрачный супернатант, не содержащий крупных субклеточных органелл (ядра, пигментные гранулы), использовали для измерения антиоксидант-ной активности.
Кардиолипиновые липосомы были получены путем суспендирования высушенной пленки кар-диолипина из сердца быка ("Sigma", USA) в 0.1 М натрий-фосфатном буфере (рН 7.3). Суспензия липосом содержала 5.0 мг/мл кардиолипина.
Кинетику пероксидации липидов в гомогена-тах глаз оценивали, измеряя накопление липид-ных гидропероксидов (ROOH) в инкубационной среде (Organisciak, Noell, 1976).
Процесс пероксидации липидов в гомогенатах глаз был индуцирован ионами Fe2+ в присутствии ас-корбата. Реакционная среда содержала 0.1 М натрий-фосфатный буфер, рН 7.4, 3.5-5.5 мг/мл белка гомогената глаз, 15 мкМ Fe(SO4)2(NH4)2SO4 ■ 6H2O и 0.5 мМ аскорбат, конечный объем - 2.3 мл. Реакцию инициировали добавлением ионов двухвалентного железа и проводили при комнатной температуре и при постоянном перемешивании на механической мешалке. В определенное время аликвоты гомогената, содержащие примерно 0.7-1.0 мг белка, были добавлены к среде, содержащей 0.1 М натрий-фосфатный буфер, рН 7.4, 1.0 мМ ЭДТА, 1.0 мМ восстановленный глутати-он, 200 мкМ НАДФН, 1.25 единиц глутатионре-дуктазы и 0.7 единиц глутатионпероксидазы. Для подсчета концентрации гидропероксидов в конце измерения к пробе добавляли 5.0-15.0 мкМ калиброванного раствора трет-бутил гидроперок-сида ("Sigma").
Для того чтобы измерить действие гомогена-тов глаз на кинетику пероксидации кардиолипи-новых липосом, процесс пероксидации кардиолипина индуцировали системой Fe2+-аскорбат. Реакционная среда содержала 0.1 М натрий-фосфатный буфер, 0.7-0.9 мг/мл кардиолипиновых липосом, 10-15 мкМ Fe2+, 0.5 мМ аскорбат и 0.2-0.3 мг белка гомогенатов глаз креветок МП и ОП в равных концентрациях, конечный объем -3.0 мл. В контрольных экспериментах равные объемы натрий-фосфатного буфера использовали вместо гомогенатов. Реакцию проводили при комнатной температуре и постоянном перемешивании. Для измерения концентрации гидропероксидов аликвоты, содержащие примерно 150 мкг кардиолипина, были добавлены к среде (состав которой см. выше).
Система индукции пероксидации кардиолипиновых липосом Fe2+-аскорбат была также использована для оценки антиоксидантной активности водорастворимой фракции гомогенатов глаз. Реакционная среда содержала 0.1 М натрий-фос-
фатный буфер, 0.75 мг/мл кардиолипиновых ли-посом, 20 мкМ Fe2+, 0.5 мМ аскорбат и 300450 мкл водорастворимой фракции. Конечный объем образцов составлял 2.0 мл, а концентрация белка водорастворимых фракций МП и ОП была одинаковой.
Содержание токоферола в гомогенатах глаз было измерено при помощи чувствительного флюориметрического метода, предложенного в работе (Taylor et al., 1976) с незначительной модификацией. Смесь для сапонификации (омыления) содержала 1.0 мл 25%-ной аскорбиновой кислоты, 1.0 мл абсолютного этанола и 1.0 мл гомоге-ната глаз в 0.1 М натрий-фосфатном буфере (концентрация белка была 3-5 мг/мл). Смесь преинку-бировали при комнатной температуре в течение 5 мин в 15 мл стеклянной центрифужной пробирке с притертой пробкой. Процесс сапонификации проводили в течение 15 мин при той же температуре, добавляя к смеси 1.0 мл 10 М КОН. После этого 4.0 мл гексана ("Merk") добавляли к омыленной смеси и интенсивно перемешивали мешалкой типа "Vortex" в течение 1.5 мин. После разделения фаз отбирали 3.0 мл нижнего гексано-вого слоя. Отобранную гексановую фазу помещали в центрифужную пробирку, добавляли 0.6 мл 60%-ной серной кислоты и энергично перемешивали мешалкой типа "Vortex" в течение 3
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.