ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2007, том 43, № 6, с. 677-684
УДК 577.12.9+579.842.24.013
СРАВНЕНИЕ СВОЙСТВ БАКТЕРИОЦИНОВ, ОБРАЗУЕМЫХ ШТАММАМИ Lactococcus lactis subsp. lactis РАЗНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
© 2007 г. Л. Г. Стоянова*, Н. С. Егоров*, Г. Б. Фёдорова**, Г. С. Катруха**, А. И. Нетрусов*
*Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет; Москва 119992
e-mail: stoyanovamsu@mail.ru **Научно-исследовательский университет по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе РАМН, Москва
Поступила в редакцию 28.01.2006 г.
Проведено сравнительное изучение бактериоцинов, образуемых четырьмя штаммами Lactococcus lactis subsp. lactis: 729 (природный штамм, выделенный из молока), 1605 (мутант штамма 729), ре-комбинантного штамма F-116, полученного методом слияния протопластов двух родственных штаммов 729 и 1605, а также низинобразующего штамма МГУ, полученного адаптивной селекцией. Исследование антимикробного спектра штаммов выявило различия в их действии на разные группы микроорганизмов, а также отличие от коммерческого препарата "Nisaplin" (бактериоцин низин). Разработаны методы выделения и очистки бактериоцинов, выделены и изучены индивидуальные компоненты антибиотических комплексов в хроматографически чистом виде. Проведена идентификация бактериоцинов, образованных разными штаммами L. lactis subsp. lactis, установлены их различия по биологическим и физико-химическим свойствам. Выделено новое отличающееся от низина высоко эффективное природное соединение широкого спектра антибиотического действия, продуцируемое рекомбинантным штаммом F-116.
Основную роль в антагонизме молочнокислых бактерий играют специфические антибиотические вещества белковой природы - бактериоци-ны, оказывающие ингибиторное действием на рост ряда микроорганизмов, включая патогенные формы - листерии, бациллы, стафилококки и др., развивающиеся в продуктах питания в процессе хранения [1, 2]. Бактериоцины рассматриваются как перспективные пищевые консерванты.
В последние годы интерес к использованию бактериоцинов и бактериоцинобразующих культур для консервирования продуктов питания резко возрос. Одним из главных преимуществ бактериоцинов, определяющих спрос на них, является возможность получения качественных и безопасных для здоровья продуктов питания без искусственных консервантов. Широко используемые в пищевой промышленности химические консерванты, увеличивающие срок хранения продуктов питания, часто могут оказывать нежелательное воздействие на организм.
Установлено, что молочнокислые бактерии Lactococcus lactis subsp. lactis продуцируют разные бактериоцины. Наиболее изученным и разрешенным для применения в качестве биологического консерванта (код Е 234) является бактериоцин низин, единственный из антибиотиков, имеющий GRAS статус (признанный как безопасный Европейской комиссией, Regulation (EC) № 258/97).
Бактериоцины молочнокислых бактерий составляют большое семейство полипептидов, которые подразделяются на различные классы: 1) лан-тибиотики, к которым относится низин; 2) термостабильные, нелантибиотические бактериоцины; 3) термолабильные бактериоцины [3]. Описаны несколько низинов B, ^ D, E, Z, R, Q) и родственных им лактицинов, отличающихся между собой по ряду физико-химических свойств, аминокислотному составу и спектру антибактериального действия [1, 3-9]. Биосинтез бактериоцинов -наследственная особенность организмов, проявляющаяся в том, что каждый штамм способен образовывать один или несколько определенных, строго специфичных для него антибиотических веществ. Известны факты, когда клетки бактерии обладали способностью продуцировать не один, а несколько типов бактериоцинов [10, 11].
Следует подчеркнуть, что генетические детерминанты синтеза бактериоцинов локализованы в бактериальной клетке вне ее хромосомы, поэтому рассмотрение способности к синтезу этих продуктов неизбежно связано с вопросом о соотношениях между хромосомными и цитоплазматическими генетическими элементами, которые могут передаваться из клетки в клетку [12, 13]. Генетические детерминанты, контролирующие синтез некоторых бактериоцинов, могут быть переданы при совместном культивировании, в процессе конъ-
югации, слияния протопластов или генно-инженерными методами.
Цель работы - выделение и сравнительное изучение некоторых биологических и физико-химических свойств бактериоцинов и других антибиотических веществ, продуцируемых штаммами L. lactis subsp. lactis разного происхождения.
МЕТОДИКА
В работе использовали четыре штамма L. lactis subsp. lactis различного происхождения: реком-бинантный штамм F-116, полученный методом слияния протопластов двух родственных штаммов 729 и 1605, один из которых (штамм 729) выделен из свежего молока без консервантов на ферме ВСХА им. К.А. Тимирязева совместно с сотрудниками Всероссийского научно-исследовательского института молочной промышленности. Штамм 1605 - мутант штамма 729, полученный в результате комбинированного воздействие УФ-лу-чей и нитрозоэтилмочевины [13]. Для сравнения был использован музейный штамм МГУ - продуцент низина, по биологическим и физико-химическим свойствам идентичный коммерческому препарату "Nisaplin" фирмы "Aplin & Barrett" (Англия) [14].
Среды и условия выращивания культур. Лак-тококки, хранившиеся в обрате (обезжиренном молоке), культивировали при 28°С в течение 17 ч в стационарных условиях в посевной среде, приготовленной на водопроводной воде с дрожжевым автолизатом (35 мг % по аминному азоту) и глюкозой (10 г/л). Полученный посевной материал в количестве 5% вносили в ферментационную среду, содержащую (г/л): NaCl - 2.0, KH2PO4 -20.0, MgSO4 - 0.2; дрожжевой автолизат - 35-40 мг% по аминному азоту, рН 6.8-7.0, и культивировали в тех же условиях. Исследовали динамику роста культур и накопление бактериоцинов в культу-ральной жидкости в течение 24 ч. Биомассу определяли нефелометрически на ФЭК-56 (Россия) при 540 нм, антибиотическую активность - методом диффузии в агар с измерением зоны подавления роста тест-культуры в мм. В качестве тест-организма использовали спорообразующую термофильную бактерию Bacillus coagulans 429. Расчет активности проводили по стандартным растворам низина (препарат "Nisaplin"), который в переводе на антимикробную активность рассчитывается как 1000 мЕ/мг [13].
Спектр антимикробного действия. Для изучения спектра антибиотического действия штаммов L. lactis subsp. lactis культивировали в стационарных условиях в ферментационной среде вышеуказанного состава. В качестве тест-организмов
использовали музейные штаммы кафедры микробиологии МГУ: 5 штаммов грамположитель-ных бактерий: Micrococcus luteus 128, M. flavus 24, Bacillus mycoides 32, B. subtilis 2, B. coagulans 429, Staphylococcus aureus 144; 6 штаммов грамотрица-тельных бактерий: Alcaligenes faecalis 82, Escherichia coli 52; Pseudomonas aeruginosa 54, P. fluore-scens, Comamonas terrigena ATCC 8461, Proteus vulgaris 206; а также три штамма грибов: Aspergillus niger 369, Penicillium chrysogenum 37, Fusarium ox-ysporum 61 и два штамма дрожжей: Candida guilli-ermondii 217, Rhodotorula aurantiaca 226.
Бациллы выращивали на органической среде, содержащей (г/л): глюкозу - 10.0; пептон - 5.0, NaCl - 5.0; агар-агар - 25.0 с добавлением бульона Хоттингера - 28 мг% по аминному азоту, (рН 7.0). Дрожжи выращивали на сусле 6-8°Б с добавлением 2.5% агар-агара, (рН 6.8); грибы также на сусле - 3-4°Б с 2.0% агара, (рН 6.0). Бактерии культивировали при 28-55°C: бациллы, стафилококки и микрококки при 37°C, E. coli - при 42°C, B. coagulans - при 55°C, дрожжи и грибы при 28°C. Для засева чашек Петри тест-культурами использовали суточные культуры в виде суспензии клеток в физиологическом растворе в количестве 1 х 109 кл./мл (по бактериальному стандарту мутности), исходя из расчета 0.1 мл суспензии в одну чашку Петри [15].
Антибиотические вещества извлекали из клеток и культуральной жидкости методом экстракции смесью ацетон-уксусная кислота-вода (4 : 1 : : 5) при 55°C в течение 1.5 ч. Растворители отгоняли в вакууме и полученный водный концентрат анализировали методами ТСХ и электрофореза на бумаге [16].
Для разделения антибиотических комплексов на фракции и получения хроматографически чистых компонентов водный концентрат экстрагировали органическими не смешивающимися с водой растворителями, экстракты объединяли, растворитель отгоняли в вакууме на роторном испарителе до получения маслянистого остатка, таким образом получали одну из фракций антибиотического комплекса - фракцию В. Для получения основной фракции комплекса - Н, к водному раствору от экстракции добавляли избыток метанола. Выпавший осадок отделяли на стеклянном фильтре и сушили в эксикаторе под вакуумом в течение 1 сут.
Хроматографический анализ. Фракции антибиотических веществ разделяли методом TCX на пластинках "SüufoГ(Чеxия) и DC-Alufolien Kieselgel 60 ("Merck", Германия) в системе метанол-вода (96:4). В этих же условиях проводили и препаративную TCX для получения индивидуальных компонентов фракций.
(а) (б)
Рис. 1. Динамика роста (1) и накопления бактериоцинов (2) штаммами Ь. ¡аеМз subsp. ¡аей,?: F-116 (а); 729 (б); 1605 (в); МГУ (г), в ферментационной среде.
Аналитический и полупрепаративный электрофорез. Электрофорез проводили на бумаге Filtrak F-14 (Германия) на V-образном приборе Дурума [17] в электролитах: Еь (рН 2.4) - 2 н. СН3СООН, 550 В, 2 ч и E2, (рН 1.1)-HCOOH-CH3COOH-H2O (28 : 20 : 52), 270 В, 2-3 ч.
Биоавтографию проводили по методике, предложенной Хасе и Келлером [18] с использованием в качестве тест-организмов B. coagulans 429 и B. subtilis АТСС 6633 (=RIA 445).
УФ-спектры получали на спектрофотометрах Shimadzu 1601C и Hitachi U-2000 (Japan).
Масс-спектры выделенных антибиотиков регистрировали на приборе VISION методом MALDI-TOF в режиме положительных ионов (лазер -азот, 337 нм, матрица - 2,5-дигидрокси-бензойная кислота).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Бактериоцины - микробные белки, обладающие антибиотическими свойствами, отличающиеся от антибиотиков тем, что их синтез происходит параллельно росту микроорганизма, синтезу ДНК, б
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.