Таблица 1. Состав подвижных фаз для анализа*
Препарат Изократический вариант Градиентный вариант
Таблетки "Ко-тримоксазол" Таблетки "Кофицил Плюс" Таблетки "Проходол-форте" Сироп "Кларисенс" Сироп парацетамола CH3CN : KH2PO4 = 1 : 4 CH3CN : KH2PO4 (pH 3.0) = 17 : 83 CH3CN : KH2PO4 (pH 3.0) = 1 : 9 CH3CN : KH2PO4 = 45 : 55 CH3CN : H2O : CH3COOH = 30 : 70 : 1 CH3CN : KH2PO4 от 0 : 1 до 1 : 1 за 10 мин CH3CN : KH2PO4 (рН 3.0) от 0 : 1 до 1 : 1 за 10 мин CH3CN : KH2PO4 (рН 3.0) от 0 : 1 до 1 : 1 за 10 мин CH3CN : KH2PO4 от 0 : 1 до 3 : 2 за 10 мин CH3CN : H2O : CH3COOH от 5 : 95 : 1 до 50 : 50 : 1 за 10 мин
* Соотношение компонентов указано в об. %.
ментации (НД). Все остальные использованные реактивы имели квалификацию не ниже ч.д.а.
Аппаратура. Хроматографический анализ проводили на хроматографе Waters Alliance 2695 с ди-одно-матричным детектором Waters 2996. Величина "мертвого" объема хроматографа по паспорту менее 0.650 мл. Использовали колонки с обращенно-фазовыми сорбентами Нуклеосил 100 С18 ("Элсико") 5 мкм и Nova-Pak C18 4.0 мкм (Waters). Длина колонок 150 мм, внутренний диаметр 4.0 мм ("Элсико") и 3.9 мм (Waters).
Приготовление растворов. Состав подвижных фаз для анализа приведен в табл. 1.
Для приготовления испытуемого раствора таблеток "Ко-тримоксазол" около 0.16 г (точная навеска) растертых таблеток растворяли в мерной колбе емк. 100 мл в 40 мл смеси (1:1) ацето-нитрил - 0.025 М раствор KH2PO4, перемешивали 10 мин, разбавляли 0.025 М раствором KH2PO4 до метки и снова перемешивали. Параллельно готовили раствор стандартных образцов сравнения (PCO), содержащий 0.020 г триметоприма и 0.100 г сульфаметоксазола (точные навески) в 100 мл смеси (1:4) ацетонитрил - 0.025 М раствор KH2PO4. Все растворы фильтровали через гидрофильный мембранный фильтр с размером пор 0.45 мкм (предпочтительны фторопластовые фильтры, устойчивые в водно-ацетонитрильных растворах).
Испытуемые растворы таблеток "Кофицил Плюс" и "Проходол-форте" готовили растворением навески соответственно 0.26 или 0.30 г в 30 или 20 мл смеси (1:1) ацетонитрил - 0.025 М раствор KH2PO4 (рН 3.0) и разбавляли до 100 мл 0.025 М раствором KH2PO4 (рН 3.0). Для приготовления испытуемых растворов сиропов 2.0 мл сиропа парацетамола растворяли в 100 мл смеси (30:70:1) метанол - вода - уксусная кислота; 5.0 мл сиропа "Кларисенс" растворяли в 50 мл смеси (45:55) ацетонитрил - 0.025 М раствор KH2PO4. Эти растворы также фильтровали через гидрофильный мембранный фильтр с размером пор 0.45 мкм.
Выполнение анализа. Общее число хромато-грамм для каждого анализируемого препарата
было не менее 12. Результаты двух первых ин-жекций, как возможно нестабильных, не учитывали. Такое число хроматограмм рекомендовано [4] для получения наиболее достоверных результатов сравнения двух выборок по воспроизводимости.
Обсчет полученных результатов проводили с помощью электронных таблиц Excel.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Хроматографический анализ, являясь динамическим по сущности, протекает во времени и пространстве. Пространством для процесса хромато-графического разделения является двухфазная система растворитель (подвижная фаза) - сорбент. В реальных условиях свойства этой системы не постоянны, что связано с неполной обратимостью сорбционных процессов и постепенным загрязнением сорбента разделяемыми веществами и присутствующими примесями. В связи с этим непостоянны как качественные, так и количественные характеристики последовательных хроматограмм, соответственно форма и площадь пиков. По нашему мнению, важнейшая метрологическая характеристика хроматографического анализа, непосредственно связанная с воспроизводимостью и правильностью количественных результатов, это - воспроизводимость площадей пиков разделяемых компонентов при последовательных инжекциях испытуемого раствора.
Для экспериментального сравнения точности результатов количественного анализа при использовании градиентной и изократической ВЭЖХ сравнивали воспроизводимость площадей пиков при последовательных инжекциях растворов пяти различных лекарственных препаратов -таблетки "Ко-тримоксазол", "Кофицил Плюс", "Проходол-форте", сиропы парацетамола и "Кларисенс". Для площадей пиков рассчитывали дисперсию s2 и отношения дисперсий для изократического и градиентного вариантов. Расчетные значения отношений сравнивали с табличными для выборок со-
СРАВНЕНИЕ ВОСПРОИЗВОДИМОСТИ ПЛОЩАДЕЙ ПИКОВ
279
Таблица 2. Сравнение воспроизводимости площадей пиков при изократическом (из) и градиентном (гр) вариантах ВЭЖХ при анализе некоторых лекарственных препаратов (Р = 0.99)
Таблетки "Ко-тримоксазол"
Параметр Триметоприм Сульфаметоксазол
-табл = 4.85 т /т ± из/ гр РСО 1.170 Проба 1.165 РСО 1.026 Проба 1.027
¿из^рС« = Ш 7.18 1.08 5.73 0.81
Сироп парацетамола
Парацетамол Бензоат натрия
-табл 4.47 т /т из гр Проба 1 1.000 Проба 2 1.002 Проба 1 1.438 Проба 2 1.435
s2J< (n = 12) 1.62 0.76 5.20 1.11
Сироп "Кларисенс"
-табл 4.47 Лоратадин Нипагин Нипазол
т /т из гр 1.240 1.205 1.310
^з^р (n = 12) 0.34 2.29 1.35
Таблетки "Кофицил плюс"
F = 3 71 F табл "" з'' 1 Парацетамол Кофеин Ацетилсалициловая кислота Салициловая кислота
т /т из гр 1.110 1.185 1.235 1.315
¿из/^р (« = 15) 5.48 5.61 5.29 1.20
Таблетки "Проходол-форте"
-табл = 2.15 Парацетамол Кофеин Фосфат кодеина
т /т из гр 1.33 1.36 1.16
¿из/^р (« = 40) 1.47 1.82 1.59
ответствующего размера (F-критерий Фишера). Полученные результаты представлены в табл. 2.
При анализе таблеток "Проходол-форте" и сиропа "Кларисенс" отношение дисперсий для всех компонентов меньше критического значения F. Это свидетельствует о равноценной воспроизводимости градиентного и изократического вариантов в рассматриваемых случаях. Иная картина наблюдается при анализе таблеток "Кофицил Плюс": для парацетамола, кофеина и ацетилсалициловой кислоты градиентный анализ позволил получить более воспроизводимые результаты. Воспроизводимость площадей салициловой кислоты (вероятная примесь) при этих двух режимах равноценна.
При анализе раствора PCO таблеток "Ко-тримоксазол" более воспроизводимы результаты градиентного анализа. Для испытуемого раствора воспроизводимость двух рассматриваемых вариантов сопоставима. Для сиропа парацетамола только для одного из двух испытуемых растворов при градиентном режиме получены более воспроизводимые результаты определения бензоата
натрия при переходе от изократического к градиентному вариантам.
Одной из причин повышения точности при переходе от изократического к градиентному режиму является изменение формы пика из-за уменьшения фактора T (tailing factor по Фармакопее США USP 23) [5], рассчитываемого по формуле: T = 2 f/W, где f - расстояние от восходящей ветви пика до перпендикуляра, опущенного из вершины к базовой линии, измеренное на 1/20 высоты пика; W - ширина пика у основания, измеренная между пересечениями базовой линии и касательными к восходящей и нисходящей ветвям пика.
На рисунке представлены пик бензоата натрия, полученный при изократическом (а) и градиентном (б) режимах и расчет фактора T. Очевидно значительное снижение T при переходе от изократического к градиентному вариантам (1.94 и 1.40 соответственно).
В табл. 2 приведены соотношения величин T для пиков других рассматриваемых веществ в изократическом и градиентном режимах. В боль-
AU
Данные для расчета "хвостового" фактора пика натрия бензоата при изократическом (а) и градиентном (б) элюировании.
шинстве случаев эти соотношения также больше единицы.
Связь между величиной "хвоста" пика и воспроизводимостью расчета его площади объясняется принципами работы программы. Начало и конец пика определяются по значению порога,
равного критической величине производной по времени регистрируемого детектором сигнала. Чем уже пик, чем больше крутизна подъема его восходящей ветви и круче спуск нисходящей и, соответственно, меньше "хвост", тем выше воспроизводимость регистрации крайних точек при заданном оператором пороге.
Результаты проведенного исследования и расчетов (табл. 2), однако, показывают, что не во всех случаях с уменьшением "хвоста" повышается точность. Это подтверждает тот факт, что воспроизводимость характеризует случайную погрешность анализа. Кроме того, при сравнении градиентного и изократического вариантов необходимо учитывать и другие факторы, связанные, в частности, с особенностями массообмена при разных режимах элюирования. Рассмотрение этих факторов выходит за рамки данной работы.
Таким образом, полученные в настоящем исследовании результаты позволяют сделать предположение, что при использовании современного хроматографического оборудования и высокочистых воды и реактивов градиентная ВЭЖХ не только не уступает по точности изократическому варианту, но может и превосходить его.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Энгелъгардт X. Жидкостная хроматография при высоких давлениях. М: Мир, 1980. С. 144.
2. Схунмакерс П. Оптимизация селективности в хроматографии. М: Мир, 1989. С. 316.
3. Современное состояние жидкостной хроматографии. Под ред. Киркленда. Дж. М: Мир, 1974. С. 117.
4. Государственная Фармакопея СССР. 11-е издание. Т. 1. С. 211.
5. The United States Pharmacopeia. 23-th ed. Rockville: United States Pharmacopeial Convention, Inc., 1994. P. 1776.
Comparison of the Precision of Peak Areas in Consecutive Injections in the Isocratic and Gradient HPLC Analysis of Some Pharmaceutical Preparations
G. B. Golubitskii", E. V. Budko*, E. M. Basovae, V. M. Ivanovd
a OAO Farmstandard--Leksredstva, Vtoraya Agregatnaya ul. 1a/18, Kursk 305039, Russia
b Kursk State Medical University, ul. K. Marksa 3, Kursk, 305004, Russia
c Dubna International University of Nature, Society, and Human Being, Universitetskaya ul. 19, Dubna, Moscow oblast, 141980 Russia
d Department of Chemistry, Moscow State University, Leninskie gory, Moscow, 119992, Russia
Abstract—An isocratic and a gradient elution modes of HPLC are compared in the analysis of five multicom-ponent pharmaceutical formulations. It is shown that in some cases, these modes have no advantages over each other in the precision of t
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.