ИЗВЕСТИЯ РАИ. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2008, № 5, с. 574-579
^ ФИЗИОЛОГИЯ
ЖИВОТНЫХ И ЧЕЛОВЕКА
УДК 591.5
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА АКТИВНОСТИ СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ И ГЛУТАТИОНПЕРОКСИДАЗЫ В ЗАРОДЫШАХ И СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦАХ ВЗРОСЛЫХ РЫБ
© 2008 г. А. Р. Исуев*, С. И. Исмаилова*, Н. Д. Озерншк**
^Дагестанский государственный университет, 367025 Махачкала, ул. М. Гаджиева, 45 E-mail: unirdag@dgu.ru **Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 117991 Москва, ул. Вавилова, 26
E-mail: ozernyuk@mail.ru Поступила в редакцию 14.05.2007 г.
Проведено сравнение активности антиоксидантных ферментов супероксиддисмутазы и глутатион-пероксидазы в эмбриогенезе вьюна и осетра, а также в красных и белых скелетных мышцах вьюна. Удельная активность цитоплазматической и митохондриальной форм суперосиддисмутазы в развивающихся зародышах осетра выше, чем у зародышей вьюна, что может быть связано с кислородными условиями развития этих двух видов в природе. Сходная зависимость показана также для глу-татионпероксидазы зародышей этих видов рыб. Сравнение удельной активности супероксиддисмутазы в зародышах вьюна и осетра, а также в скелетных мышцах вьюна показало, что наиболее высокая активность цитоплазматической формы фермента характерна для красной и белой мускулатуры, а наименьшая - для зародышей вьюна, тогда как активность митохондриальной формы наиболее высокая в красных скелетных мышцах.
Использование молекулярного кислорода живыми организмами привело к формированию в ходе эволюции двух важнейших метаболических процессов. Во-первых, в клетках появились механизмы утилизации кислорода за счет использования его как универсального конечного акцептора электронов при окислении различных субстратов. Во-вторых, клетки эукариотических и отчасти прокариотических организмов, постоянно сталкиваясь с активными формами кислорода в процессе жизнедеятельности, выработали физиологические и молекулярные механизмы защиты от токсического действия этого соединения. Различные живые существа значительно отличаются по чувствительности к содержанию кислорода в среде, и даже сравнительно незначительное увеличение его концентрации может иметь катастрофические последствия для организма.
В основе токсического действия высоких концентраций кислорода лежит его способность активировать образование в тканях активных форм кислорода - радикала супероксид-аниона (О^-), перекиси водорода (Н202) и гидроксил-радикала (ОН-) (ОегееЬтап, 1969; Скулачев, 1969, 1989; Андреев и др., 2005; Зоров и др., 2005). Защита от активных форм кислорода осуществляется различными механизмами: за счет снижения их образования путем уменьшения потребления кислорода
или его более быстрого использования дыхательной цепью, а также функционированием антиокислительной системы (Скулачев, 1969, 1989; Исуев, Тарусов, 1975; Asada, Kanamatsu, 1976; Чернышов, Исуев, 1978; Shull et al., 1991; Кулинский, 1999; Исуев и др., 2000; Lushchak et al, 2001). Антиоксидантная система включает как низкомолекулярные анти-оксиданты, так и антиоксидантные ферменты. Важнейшая роль ферментативной защиты в клетке принадлежит ферментам супероксиддисмутазе (СОД), глутатионпериксидазе (ГПО), каталазе и глутатионтрансферазе (Андреев и др., 2005). Следует отметить, что активность СОД, катализирующей метаболизм супероксидных радикалов, в различных тканях тесно коррелирует с уровнем окислительно-восстановительных процессов: чем интенсивнее потребление кислорода, тем выше активность этого фермента (Lynch, Fridovich, 1978; Halliwell, Gutteridge, 1985; Izokun-Etiobhio et al, 1990; Lushchak et al., 2001). При увеличении длительности токсического воздействия кислорода наблюдается истощение антиоксидантной защиты и повышается скорость перекисного окисления липидов. Обязательное присутствие антиоксидантной системы почти во всех клетках животного и растительного происхождения указывает на важность выполняемых ими функций - метаболизма активных форм кислорода. Эти продукты окисления кислорода, с одной стороны, выполня-
ют важные физиологические функции, с другой -их накопление токсично и опасно для клетки.
При умеренном избытке кислорода в среде наблюдается изменение скорости развития зародышей, свидетельствующее о том, что в этих условиях метаболические процессы не нарушаются. Энергетический обмен зародышей нарушается лишь при значительном увеличении концентрации кислорода. Торможение развития в этом случае обусловлено, как предполагается, инактивацией ряда дыхательных ферментов (Bean, 1963), ин-гибированием некоторых кофакторов этих ферментов, а также подавлением процессов окислительного фосфорилирования (Perova, Vallejo, 1982).
В основе неодинаковой чувствительности зародышей разных видов животных к действию избытка или дефицита кислорода лежит разная степень надежности их антиоксидантной защиты (Исуев, Тарусов, 1975; Чернышов, Исуев, 1978). В пользу данного предположения говорит также то, что токсическое действие высокой концентрации кислорода, как это показано на примере зародышей рыб, можно намного снизить в результате их обработки глутатионом, обладающим антиоксидантной активностью (Исуев, 1993).
В процессе эмбрионального развития одновременно с ростом и дифференцировкой зародыша происходит становление его энергетического обмена, выражающееся в усложнении механизмов потребления кислорода. Одной из важных сторон данного процесса является также становление антиокислительной системы - ее неферментативного и ферментативного компонентов. Физиологическая роль некоторых низкомолекулярных антиоксидантов изучена ранее (Исуев, Тарусов, 1975; Чернышов, Исуев, 1978; Кулинский, 1999). Следует отметить, что исследования участия антиокислительных ферментов в поддержании го-меостаза в раннем онтогенезе рыб и в приспособительных реакциях к меняющимся условиям среды немногочисленны и часто противоречивы.
Цель работы состояла в исследовании динамики активности антиоксидантных ферментов СОД и ГПО в эмбриогенезе рыб, развитие которых протекает в различных по содержанию кислорода условиях.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Работу проводили на зародышах вьюна (Mis-gurnus fossilis) в лабораторных условиях в Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН и на зародышах осетра (Acipenser guldenstadti) на Нечаевском рыбоводном заводе (Республика Дагестан). Икру вьюна получали после инъекции самкам гонадотропного гормона хориогонина (Костомарова, 1970; Нейфах, 1974). Стадии раз-
вития осетровых определяли по таблицам Дет-лаф и Гинзбург (1954).
Митохондрии выделяли по общепринятому методу Хогебум (Hogeboom, 1955) с некоторыми модификациями. Икру гомогенизировали в гомогенизаторе Поттера с 10 мл трмс-HCl, рН 7.5. Го-могенат центрифугировали при 800 g в течение 15 мин. Осадок удаляли, а надосадочную жидкость еще раз центрифугировали при тех же условиях. Далее надосадочную жидкость центрифугировали при 10000 g в течение 10 мин. Осадок митохондрий дважды промывали средой выделения и осаждали центрифугированием. Полученный осадок использовали в качестве препарата митохондрий для определения в них активности антиоксидантных ферментов. Активность ферментов в цитозольной фракции рассчитывали на основе измерения суммарной ферментативной активности клеточных экстрактов и вычитания из этих данных активности митохондриальной фракции.
Измерение активности СОД проводили по методу Бешампа и Фридовича (Beauchamp, Fridovich, 1971). Реакционная смесь содержала 2.5 х 10-5 М тетразолиевого синего, 1 х 10-4 М ксантина, 1 х х 10-4 М ЭДТА в 0.05 М натрийкарбонатном буфере, рН 10.2, в конечном объеме 3 мл при 30°С. Реакцию запускали добавлением ксантиноксида-зы в кювету и следили за скоростью восстановления тетразолиевого синего с помощью регистрирующего спектрофотометра Unicam Sp-8000 (Philips, Великобритания) при 560 нм. Удельную активность рассчитывали в Е/мг белка. Приготовление растворов проводили на деионизиро-ванной воде, так как примеси металлов мешают определению активности СОД.
Активность ГПО определяли по методу Сан-да и Гекстра (Sunde, Hoekstra, 1980). Реакционная смесь содержала 5 мМ калийфосфатного буфера, рН 7.0, 0.12 мМ НАДФ, 0.85 мМ восстановленного глутатиона, 1 мМ ЭДТА, 1.0 единиц глу-татионредуктазы. Реакция запускалась внесением 0.3 мл водного раствора гидроперекиси mpem-бутила. Удельную активность рассчитывали в Е/мг белка.
Статистическая обработка полученных данных проводилась по Плохинскому (1961) с последующей оценкой различий Р < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Удельная активность цитоплазматической и митохондриальной форм СОД в эмбриогенезе вьюна и осетра существенно отличается. На рис. 1а представлено изменение активности двух форм СОД в ходе эмбрионального развития вьюна. Если удельная активность цитоплазматического фермента в этот период претерпевает небольшие
л м
ч
щ
ю
и ^
и
>4
н о о м я к н
м <
(а)
2
10 20 30 40
Дробление Органогенез
Гаструляция Вылупление
¡2 20 л
е
^ 16 г
£
И 12 л
В 8
о н
§ 4
т
м
< 0
(б)
10
Дробление
Гаструляция
20 30
Органогенез
Вылупление
40
Время, ч
Материал Цитоплазматиче-ская форма фермента Митохондриаль-ная форма фермента
Красные мышцы 37.2 ± 4.6 15.6 ± 2.1
Белые мышцы 36.4 ± 3.1 1.05 ± 0.2
Икра вьюна 8.5 ± 1.1 1.5 ± 0.3
Икра осетра 18.1 ± 1.9 5.8 ± 0.04
а
м
л
е
ю
г
(а)
10
40
20 30
Дробление Органогенез
Гаструляция Вылупление
(б)
20 16 12
В 8
о н
я 4
12
10
Дробление
Гаструляция
20 30
Органогенез
Вылупление
40 Время, ч
Рис. 1. Изменение удельной активности СОД в ходе зародышевого развития вьюна (а) и осетра (б). 1 - ци-топлазматическая форма фермента, 2 - митохондри-альная форма фермента. По оси абсцисс - стадии развития (для рис. 1, 2).
колебания, то активность митохондриальной формы снижается во второй половине эмбриогенеза (органогенез и стадии перед вылуплением зародышей). Следует отметить, что на всех стадиях эмбрионального развития удельная активность цитоплазматической формы СОД существенно выше по сравнению с активностью митохондри-альной формы.
У осетра, в отличие от вьюна, в ходе эмбрионального развития активность цитоплазматической формы
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.